墨旱莲对胸腺细胞凋亡影响的研究

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1、墨旱莲对胸腺细胞凋亡影响的研究作者：庄晓燕杨菁王怡薇景辉白秀珍【摘要】目的：研究墨旱莲水煎剂对不同药物诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型细胞凋亡的影响。方法：制作以环磷酰氨诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型和以氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型;用不同浓度的墨旱莲水煎剂对其治疗，用电镜或荧光显微镜观察其形态变化;用流式细胞仪等检测胸腺细胞凋亡情况。结果：以环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型组小鼠和以氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型组小鼠，胸腺均出现典型细胞凋亡表现;用不同浓度的墨旱莲水煎剂对其治疗，均使细胞凋亡情

2、况得到一定抑制，且有计量依赖性。环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.15%;环磷酰氨组胸腺细胞亡凋率30.25%;各治疗组(3～7组)依次分别是28.76%、26.14%、12.06%、3.24%、3.6%。氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型组，流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.33%;氢化可的松组胸腺细胞亡凋率22.78%;墨旱莲各组(2～4组)依次分别是2.33%、2.31%、2.31%;治疗各组(6～8组)分别是16.52%、9.74%

3、、4.26%。结论：环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功;氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功。墨旱莲水煎剂可以抑制以环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡，也可以抑制氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡，而对正常细胞几乎没有影响。故墨旱莲水煎剂对小鼠免疫功能有调节作用。11【关键词】墨旱莲;环磷酰胺;氢化可的松;小鼠;胸腺;细胞凋亡墨旱莲为菊科植物鳢肠的干燥地上部分。墨旱莲很早就应用于临床，有扶正固本、滋补肝肾、凉血止血的功效[1]，主要用于出血性疾病、牙齿松动、须发早白、阴虚血热、肝肾亏损等。本研

4、究探讨墨旱莲对以环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡和以氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的免疫调节作用。　　1材料和方法　　1.1实验动物　　昆明种小鼠，3～4周龄，体重18～22g，雌雄各半，150只，由辽宁医学院实验动物中心提供。　　1.2药品和试剂　　墨旱莲干燥全草，购自锦州市成大方圆药店，制成浓度为1g/ml的水煎剂。磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)的配制：Nacl4g、Kcl0.1g、KH2PO40.1g、Na2HPO3，12H2O1.442g三蒸水定容至500ml，411℃保存。吖啶橙染色液的配制：吖

5、啶橙10mg溶于10mlPBS中(PBS的pH<3)4℃保存。碘化丙啶染色液的配制：取碘化丙啶5mg、RNaseA5mg、枸橼酸钠100mg、曲拉通-1001ml，加65ml生理盐水完全溶解后，用三蒸水定容至100ml，4℃避光保存。环磷酰胺(上海第二制药厂);氢化可的松(齐齐哈尔第二制药厂);RNA酶A(华美公司);其他试剂均为国产分析纯。　　1.3主要仪器　　透射电子显微镜(日本JEM1200EX型);超薄切片机;(日本LKB5型);流式细胞仪(美国B.D公司FACScanCellQues

6、t分析系统);高速冷冻离心机(TGLL18G型)等。　　1.4动物模型的制作　　1.4.1环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型的制作：将70只小鼠隋机分成7组，正常对照组、环磷酰胺组、5个墨旱莲治疗组(简称治疗组)，每日每公斤体重分别给墨旱莲2g、4g、8g、16g、25g，连续6d以墨旱莲水煎剂灌胃;正常对照组腹腔注射生理盐水;环磷酰胺组和各治疗组第4天腹腔注射环磷酰胺50mg/Kg体重。11　　胸腺细胞悬液的制备：末次给药24h后，颈椎脱位法处死小鼠，取胸腺于平皿内用PBS清洗干净，用眼科剪剪碎，过

7、200目筛网制成细胞悬液，置离心管中，800～1000r/min离心10min。用0.01mol/L的PBS重悬细胞，即为胸腺细胞悬液。　　胸腺细胞凋亡的形态学观察：将胸腺细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中，2000r/min离心15～20min，使细胞成团;小心吸去上清加入2.5%戊二醛固定液固定细胞团。取出琼脂，切下含有细胞团的琼脂块。将含有细胞团的琼脂块投入装有戊二醛固定液的小瓶中，4℃保存。用0.1mol/L的PBS洗1次，1%锇酸后固定30～60min。用超薄切片机切片，加醋酸铀染色30min，

8、用透射电镜观察、拍照。　　凋亡细胞的检测：依上法制备胸腺细胞悬液，调整细胞数为1×107/ml;用3mlPBS洗1次，1000r/min离心10min，去PBS;加入预冷的70%乙醇固定，4℃放置24h;1000r/min离心10min，去固定液;3mlPBS重悬5min，1000r/min离心10min，去PBS;加入1ml碘化丙啶染色液，4℃避光放置30min;流式细胞仪检测。　　1.4.211氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型的制作