t细胞疫苗对hcv的清除作用

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1、T细胞疫苗对HCV的清除作用作者：郝春秋，冯志华，周永兴，聂青和，贾战生，谢玉梅，康文臻，陈伟红，张岩【关键词】丙型肝炎病毒；T细胞疫苗；细胞毒性T淋巴细胞　　1材料和方法　　1.1材料　　雌性BALB/c小鼠(H2d)5~6wk龄；P815细胞(H2d，仅表达MHCⅠ类抗原，不表达MHCⅡ类抗原)；SP2/0(H2d)细胞；表达丙型肝炎病毒（HCV）结构蛋白的质粒载体pcDNAC、pcDNACE1、pcDNACE1E2［1］；腺病毒表达载体pAd.HCVC、pAd.HCVCE1、pAd.HCV

2、CE1E2［2］；Na51CrO4；抗CD8+单克隆抗体；小鼠抗HCVC单克隆抗体；重组鼠源性IL2；2巯基乙醇等.　　1.2方法4　　按选定的查找序列特征，参考已发表的有关HCVCTL表位多肽的文献［3,4］，寻找并确定了HCVH株序列上可与BALB/c小鼠H2d分子结合的五条细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位多肽P1～P5，进行合成、纯化及鉴定.取5～6wk龄的雌性BALB/c小鼠45只编号称重，按完全随机数字法分为5组(P1～P5)，每组9只，然后将每组再分为3个亚组，每亚组有小鼠3只，分别

3、用重组HCV腺病毒载体、重组HCV质粒载体和相应空载体对照免疫.取免疫好的各组小鼠的脾细胞，以各自相应的特异性CTL诱导培养液(含相应的CTL表为多肽)诱导、增殖、培养，获得HCV结构基因T细胞表位多肽特异性CTL(T细胞疫苗)，备用.P815细胞分别用含5种不同HCV结构基因CTL表位多肽的培养液诱导、培养后作为靶细胞，以准备好的各组T细胞疫苗为效应细胞，采用51Cr释放法检测T细胞疫苗的体外杀伤活性，同时用抗鼠CD8单抗作阻断试验。将接种了表达HCV结构蛋白SP2/0细胞的雌性BALB/c小

4、鼠（HCV荷瘤模型）随机分组，分别用5种表位多肽诱导的T细胞疫苗进行治疗，并用表达HCV结构基因的DNA疫苗(质粒DNA)进行治疗对比，观察并记录成瘤时间、肿瘤大小和小鼠存活时间.　　2结果　　①5条HCV结构蛋白区CTL表位多肽由赛百盛公司合成、纯化及鉴定，纯度均在95%以上.②用CTL表位多肽诱导后，脾细胞的CD8阳性率显著升高（16.5%；11.5%）；用质粒载体诱导后，CD8阳性率也能明显升高（14.2%；11.8%）；两者比较发现，腺病毒载体的免疫效果优于质粒载体.③CTL体外杀伤试验

5、表明，用CTL表位多肽诱导的T细胞杀伤率在腺病毒载体免疫组（77.5%；21.8%）和质粒载体免疫组(52.7%；18.6%)都比对照组明显增高，其中腺病毒组又明显优于质粒组；该杀伤活性可以被抗CD8单抗阻断.④对HCV荷瘤小鼠模型的体内抑制试验表明，T细胞疫苗可以明显延长小鼠的成瘤潜伏期（d,33.60±4.26vs14.7±2.7,P＜0.05）和模型小鼠的存活时间（d,586±76vs28.5±6.4,P＜0.05），在相同的生长时间内，T细胞疫苗治疗组的移植瘤重量明显小于对照组.对比治疗

6、试验表明，T细胞疫苗对移植瘤的抑制作用优于DNA疫苗.4　　3讨论　　T细胞疫苗是利用T淋巴细胞特异性表位多肽在体外诱导产生特异性的CTL，被克隆、扩增、筛选和鉴定后，以疫苗的形式输入机体，诱导机体产生特异性的细胞免疫应答.由于其避免了多肽疫苗存在的许多问题［4-5］，而且直接回输CTL，可以人为地控制CTL的强度，避免其过度，导致大量受染肝细胞死亡，也可避免其过低，无清除病毒作用，因而被认为是一种具有较好发展前途的新型抗病毒疫苗.　　本研究主要探讨抗HCV的T细胞疫苗的制备方法及其在体内外的杀

7、伤活性.由CTL表位多肽诱导的预先由表达HCV结构蛋白的腺病毒载体致敏的脾细胞在体外可以产生较高的特异性CTL杀伤活性，可以用作HCV特异性MHCI限制的CD8+T细胞疫苗。模型小鼠体内实验表明，它在延缓移植瘤形成、抑制移植瘤生长和延长模型小鼠生存时间方面都有很好的效果，且明显优DNA疫苗.这些动物模型体内的实验结果与体外基本吻合.从体内实验还可以看出，诱导前未经免疫致敏的T细胞疫苗虽然也有一定的活性，但明显低于免疫致敏组.在制备T细胞疫苗时，特异性表达载体致敏(腺病毒载体要优于质粒载体)是提高

8、其活性的重要手段，这实际上是集中了腺病毒载体疫苗、DNA疫苗和T细胞疫苗的共同优势而获得的.实验结果提示，T细胞疫苗在未来的抗HCV治疗和预防中有广阔的前景［1-2］.　　【参考文献】　　［1］4冯志华，周永兴，李谨革，等.小鼠HCV皮下移植瘤的建立及DNA疫苗对其的治疗作用［J］.中华微生物与免疫学杂志，2001；21(1)：55-57.　　［2］郝春秋，冯志华，周永兴，等.复制缺陷型HCVC基因腺病毒表达载体的构建包装及鉴定［J］.世界华人消化杂志，2003;11(2)：144-147.