hcv感染huh7细胞模型的构建及mirna对hcv rna的抑制作用

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1、分类号貼１密级公开ＵＤＣ６１０学校代码１０巧５；硕：ｔ学位论文遲；■（专业学位）’毫ＨＣＶ感染Ｈｕｈ７细胞模型的构建及ｍｉＲＮＡ对赶ＣＶＲＮＡ的抑制作用研究生姓名：马涛指导教师、职称；蒋孝华主任医师专业学位类别（领域）：临床医学（传染病学）研究方向：慢性肝病的防治一所在学院；第临床学院？二〇—五年五月＠，素＃义掌ＨＣＶ感染Ｈｕｈ７细胞模型的拘建及ｍ巧ＮＡ对ＨＣＶＲＭ的抑制作用．马条论文作者签名．指导教师签名：１论文评阅人；谭立志教授评阅人２：彭舉英

2、教授评阅人３；答辩委员会主席：万艳平教授１委员：张艳教授委员２：蘭四海教授—３委员：尹凤鹏教授委员４：郑兴教授５委员；委员６：答辩日期：２０１５年５月２１日南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加切柄；注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文

3、中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法俸结果由本人承担。作者签名；年＾月ＷＴ０南华大学学位论文版权使用授权书本学位论义是本人在南华大学攻读／（博硕）±学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得凶其它。、单位的名义发表本人同意南华大学有关保留使用学位论文的规定，目日：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可Ｗ公布学位论文的全部或部分内容，可＾苗采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部口规定送交学位论文。同意学校将论文如入《中国优秀博硕±学位论文全文

4、数据库》，并按《中国优秀博硕±学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关极益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。对于涉密的学位论，并通过网络向社会公众提供信息服务文，解密后适用该授权。一作者签名：聋碱年月日导师签名：〇，＞户年！Ｔ月的巧HCV感染Huh7细胞模型的构建及miRNA对HCVRNA的抑制作用摘要目的：建立丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus，HCV）体外自然感染Huh7细胞模型，研究miRNA能否有效抑制HCV感染细胞中1b型HCVRNA的复制。方法：1.将Huh7细胞与含高浓度HCV

5、RNA的丙型肝炎病人血清(HCV1b型)共同孵育72h，实时定量PCR（Q-PCR）检测感染细胞内HCVRNA水平。并收集感染后不同时间的细胞及培养上清液，采用逆转录PCR(RT-PCR)检测感染细胞内及培养上清中HCVRNA正、负链的表达；WesternBlot检测感染Huh7细胞内HCVCore和NS4B蛋白的表达。2.利用脂质体介导将HCV1b基因型Core、NS4B的干扰质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Core（miR-Core）、pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-NS4B（miR-NS4B）分别和共同瞬时转染至感染的Huh7细胞，同时以

6、转染空载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-negative（miR-negative）、未转染的感染Huh7细胞作为阴性对照（分别转染3μg/ml和6μg/ml两种浓度的干扰质粒），以孵育干扰素作为阳性对照（干扰素浓度为3000IU/ml，约等于3μg/ml），转染48h后用Q-PCR检测感染Huh7细胞内HCVRNA的表达。结果：1.采用Q-PCR检测到感染Huh7细胞内高水平的HCVRNA表达。采I用RT-PCR法在HCV感染后第3、6、9、12、16、20、25、30天均能持续检测到细胞内和培养上清中HCVRNA正链的表达，第3、6、9、12、20天能间

7、断检测到HCV负链RNA的表达；WesternBlot检测到HCV感染细胞内HCVCore和NS4B蛋白的表达,对照细胞内未检测到。2.在干扰质粒浓度为3μg/ml的感染Huh7细胞中，miR-Core、miR-NS4B、miR-Core+miR-NS4B组的5’NTRmRNA相对表达量均低于空白对照组和miR-negative组（p<0.01），均高于阳性对照组p<0.01）；其余组间比较均无统计学意义（p>0.05）；在干扰质粒浓度为6μg/ml的感染Huh7细胞细胞中，miR-Core、miR-NS4B、miR-Core