hcv core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学性状的影响

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名：声玉耳导师签章磐象仁二级学院领导盖章：7口15年弓月司日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成

2、果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：声0耻导师签章：加J孑年弓月)1日万方数据目录中文摘要l英文摘要4英文缩写8研究论文HCVcore蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学行为的影响前言9材料与方法”10结果··27附图··30附表··39讨{仓．．··44结{仑47参考文献·48综述丙肝病毒颗粒对宿主细胞的侵入，组装和释放··50致谢一61个人简历·62万方数据中文摘要HCVcore蛋白作用的巨

3、噬细胞培养上清对肝细胞生物学行为的影响摘要目的：丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus)是引起肝脏疾病的重要病原体，感染者大部分发展为慢性感染，最后可导致肝纤维化，肝硬化和肝癌，而且目前还没有有效的疫苗来预防HCV的感染。聚乙二醇化干扰素-Q(pegylatedinterferon0【，PEG-IFN．仪)和利巴韦林(ribavirin，RBV)是治疗丙肝的最佳药物，但仍有约为30％．50％的HCV感染者对该联合抗病毒治疗无效。HCVcore蛋白是病毒感染肝细胞后第一个表达的蛋白，在感染的靶细胞和患者的血

4、清中均可检测到其存在。HCVcore蛋白不仅参与病毒颗粒的组装，还可与靶细胞不同蛋白相互作用调节靶细胞的功能，包括细胞的增殖，生长，凋亡等。固有免疫应答是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线，肝脏组织中的库否氏细胞是重要的固有免疫应答细胞，属于定居的巨噬细胞，参与机体的免疫防御。目前认为，巨噬细胞是一类异质性很强的细胞群体，在组织微环境中可被刺激分化为具有不同功能的细胞亚群。包括经典活化的M1巨噬细胞、旁路活化的M2巨噬细胞、肿瘤相关的巨噬细胞等。本室前期结果研究发现，HCVcore蛋白可刺激巨噬细胞THPl分泌

5、促炎和抑炎因子，因此，本研究拟通过收集HCVcore蛋白作用的THPl上清，从不同的角度观察培养上清对正常肝细胞株L02、肝癌细胞株(HepG2、SMCC．7721)的增殖、迁移、侵袭以及对干扰素作用的影响，并初步探讨其机制，为进一步研究HCVcore蛋白对巨噬细胞活性的影响提供实验依据。方法：1构建与表达重组HCVCOre蛋白从JFH．1株(HCv2a)全长基因质粒上通过PCR的方法扩增HCVcore基因，连接至pMDl8．T载体上，测序正确后，经BamHI，HindⅢ双酶切，与pET28a相连，构建重组原核

6、表达质粒pET28a-HCVcore，双酶切鉴定。经IPTG37。C诱导获得表达core蛋白的包涵体，经纯化，复性和浓缩后，万方数据中文摘要行SDS-PAGE和Westernblot鉴定。2获得HCVcore蛋白作用的巨噬细胞m．THPl培养上清PMA(10ng／m1)诱导人单核细胞株THPl分化为巨噬细胞m．THPl，HCVcore蛋白以20pg／ml刺激m．THPl24h后收集上清，离心。．800C保存备用。同时设PBS阴性对照组与加HCVcore蛋白无细胞的空白对照组。3观察细胞培养上清对肝细胞生物学行为

7、的影响将收集的细胞培养上清用完全培养基20％或50％稀释后分别培养人正常肝细胞L02、肝癌细胞HepG2或SMMC7721细胞：1)通过细胞增殖实验(CCK8法)，划痕实验，Transwell细胞迁移实验及克隆增殖实验观察稀释后的培养上清对上述肝细胞细胞增殖，迁移能力的影响；2)通过实时定量PCR检测三种肝细胞株MMP2和MMP9基因的表达变化；3)Westemblot检测三种肝细胞内转录因子NF．r．Bp65及MAPKs通路相关蛋白(ERK，JNK，p38)的表达。4观察细胞培养上清和IFN．a对肝细胞增殖的

8、影响在96孔细胞培养板中分别培养L02、HepG2和SMCC7721三种肝细胞，待细胞贴壁后更换培养基(含IFN．a1000U／孔)，lh后加入不同组分的细胞培养上清，使各孔终体积均为200ul，分别在刺激肝细胞24h、48h时检测其增殖变化。以了解在core蛋白作用的THPl产物对干扰素抗病毒作用的影响。设组情况如下：core蛋白作用的THPl的细胞培养上清删．o涑0激组为实验组，同