rna干扰twist基因对人膀胱癌t24细胞化疗敏感性的影响

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1、RNA干扰Twist基因对人膀胱癌T24细胞化疗敏感性的影响作者：沈彬管旌旌胡敬海王春喜【摘要】目的构建转录因子Twist基因的短发卡状RNA(shRNA)质粒，转染人膀胱癌T24细胞株后检测T24细胞对羟基喜树碱（HCPT）的敏感性。方法体外构建Twist基因shRNA的表达质粒，脂质体法介导将其转染入T24细胞。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组。采用RTPCR法和Western印迹法检测转染后TwistmRNA及蛋白的表达。使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)及流式细胞术（FCM)测定Twists

2、hRNA转染T24细胞后细胞对HCPT敏感性的改变。结果TwistshRNA转染组细胞TwistmRNA和蛋白的表达与其他两组相比明显下调(P＜0.05)；HCPT敏感性与正常对照组相比明显提高(P＜0.05)。结论靶向Twist基因的序列特异性shRNA可增强T24细胞对HCPT的敏感性。【关键词】RNA干扰;羟基喜树碱;短发卡样RNA;Twist基因6膀胱癌是我国最常见的泌尿系肿瘤,高发年龄为50～70岁，复发率高是其显著特点,因此绝大多数患者在进行肿瘤切除手术后需进行膀胱灌注化疗。羟基喜树碱(HCPT)是从

3、珙桐科植物喜树中提取的微量生物碱，作为腔内灌注治疗膀胱癌的常用药,取得了一定的治疗和预防效果。随着基因治疗技术研究的逐步深入，大家逐渐认识其存在着局限性。为了弥补基因治疗的不足，本实验用Twist基因联合HCPT对人膀胱癌T24细胞的体外杀伤作用进行比较,为基因治疗联合化疗药物治疗膀胱癌提供一定的实验依据。1材料与方法1.1材料Twist短发卡状RNA(shRNA)已由本实验室构建成功并证实可下调T24细胞中Twist基因mRNA和蛋白的表达〔1〕。脂质体转染试剂(Lipofectami2000)购于Invit

4、rogen公司。膀胱癌T24细胞株购自中科院上海细胞研究所细胞库，胎牛血清和IMDM细胞培养基购自天津TBD公司。HCPT针剂由湖北黄石飞云制药有限公司出品。细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。1.2实验方法1.2.1TwistshRNA质粒构建和筛选〔1〕TwistshRNA干扰序列：GCTGAGCAAGATTCAGACCCT。Twist基因引物:上游5′GGGAGTCCGCAGTCTTACGA3′，下游5′CCAGACCGAGAAGGCGTAGC3′，表达长度277bp。人内参GAPD

5、H基因引物序列:上游5′AGCCACATCGCTCAGACAC3′，下游5′GAGGCATTGCTGATGATCTTG3′。61.2.2MTT法测定细胞对HCPT的药物敏感性实验分为正常细胞组、转染阴性对照质粒细胞组和转染TwistshRNA细胞组。取对数生长期细胞接种于96孔板(1×104cells/孔)，加160μl培养液37℃培养24h后加入终浓度为0.01、0.1、1、5、10、50、100mg/LHCPT，每个浓度设6个复孔;继续培养48h后加入20μl(5g/L)MTT。再培养4h后尽量吸干培

6、养液,加入200μl二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解10～15min。上酶联免疫分析仪测每孔吸光度值(A值)，波长490nm，计算HCPT半数抑制浓度(IC50),实验重复3次。抑制率=〔(阴性对照A值-实验组A值)/阴性对照A值〕×100%。以药物浓度数值为横轴,抑制率为纵轴绘制浓度效应曲线。1.2.3流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况收集0.1mg/LHCPT处理的不同组膀胱癌细胞,PBS洗涤2次，按照试剂盒说明书依次加入AnnexinV和碘化丙碇(PI)溶液,避光作用15min。上COULTEREPICSXL型流

7、式细胞分析仪检测细胞凋亡,其中每次至少计数10000个细胞,每个样品分别做2次,采用Multicycle分析软件分析。1.3统计学分析采用SPSS11.5统计软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。2结果62.1MTT法测定T24细胞对HCPT的药物敏感性MTT结果显示随HCPT浓度的增加,正常细胞组、转染阴性对照质粒组和转染TwistshRNA组细胞的存活率均呈下降趋势,具有明显的剂量效应关系(图1)。在设计的HCPT浓度范围内,转染TwistshRNA组细胞存活率均低于两对照组细

8、胞。转染TwistshRNA组细胞对HCPT的IC50明显降低,为(1.09±0.23)mg/L，与正常细胞组(2.85±0.31)mg/L和转染阴性对照质粒组(2.68±0.38)mg/L相比差异显著(P＜0.05)。2.2流式细胞术检测各组细胞凋亡情况FCM结果显示,各组细胞加0.1mg/LHCPT48h后,正常细胞组的凋亡指数为16.7%±9.6%、转染阴性对照质粒