nt4antshepherdin［7987］融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

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1、NT4AntShepherdin［7987］融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定作者：汤小江,平宝华,潘承恩,杨广笑,王全颖【摘要】　　目的:设计构建融合基因NT4AntShepherdin［7987］的重组腺相关病毒表达载体。方法:应用非对称引物/模板法,PCR技术制备AntShepherdin［7987］cDNA片段,通过连接pGEMTEasy载体及PBV220NT4质粒,转化感受态细胞,获得NT4AntShepherdin［7987］融合基因,连接腺相关病毒穿梭质粒pSS

2、HGCMV,采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK293细胞获取重组腺相关病毒,Dotblot法测定重组病毒滴度,MTT比色法观察重组腺相关病毒对A549细胞存活率的影响。结果:合成AntShepherdin［7987］基因,连接PBV220NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4AntShepherdin［7987］目的基因;得到高滴度的（3.4×1013pfu/L）重组腺相关病毒表达载体;带有融合基因NT4AntShepherdin［7987］的重组腺相关病毒对

3、A549细胞具有强烈的诱导凋亡作用。结论:成功构建了NT4AntShepherdin［7987］融合基因的重组腺相关病毒表达载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。【关键词】Survivin;Ant;NT4;融合基因;重组腺相关病毒7　　Survivin是由Ambrosini等［1］于1997年发现的,是凋亡抑制蛋白（inhabitofapoptosisprotein,IAP）家族的重要成员。Survivin基因位于人类17号染色体的q25区,全长14.7kb,编码含142个

4、氨基酸,相对分子质量（Mr）为16500的胞质蛋白。Survivin在大多数实体瘤及血液系统肿瘤中,Survivin呈现高表达,在大多数终末组织不表达［2］。这种独特的表达特性使其成为恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点,近年来针对Survivin进行了广泛的肿瘤靶向治疗研究,包括有:反义寡核苷酸、显负性突变体、核酶、小干扰RNA（SiRNA）、疫苗及免疫治疗、小分子拮抗物等［3］。近来研究发现,热休克蛋白90（Hsp90）可以与Survivin结合,保护Survivin不被泛素蛋白酶体降解［4］。Survivin

5、与Hsp90结合区位于其Lys79至Leu87区域,因而,有研究者设计与其相同序列的9肽,命名为Shepherdin［7987］。作为拮抗物,Shepherdin［7987］竞争干扰Survivin与Hsp90结合,促进Survivin降解,实验表明具有很好的抗肿瘤效果,且无明显的毒副作用［5］。基于此,我们设计构建了包含细胞穿膜肽及信号肽功能的NT4AntShepherdin［7987］融合基因的腺相关病毒载体,为实现以Shepherdin为抗肿瘤目的肽的基因治疗奠定基础。　　1材料和方法　

6、　1.1材料克隆载体pGEMTEasy质粒（50ng/μ7L）购自Promega公司;限制性内切酶NaeI、BamHI、EcoRI、TaqDNA聚合酶,T4DNA连接酶、TRIzol试剂盒等试剂购自华美生物工程公司;pBV220NT4质粒,辅助质粒pAAVAd,腺病毒全基因组质粒pFG140,腺相关病毒穿梭质粒pSSHGCMV,293细胞系,大肠杆菌TOP10、E.coliDH5α菌株、A549人肺癌细胞系等由西安华广生物工程公司提供。　　1.2方法　　1.2.1引物设计与合成根据GenBank提

7、供的人Survivin7987位氨基酸序列KHSSGCAFL及细胞穿膜肽Ant（黑腹果蝇触足肽Antennapedia）的异构体氨基酸序列GRQVKVWFQNRRMKWKK设计融合序列,并根据哺乳动物偏爱密码子反翻译成基因序列。采用非对称引物/模板法,设计正、负向引物/模板链,正向引物的5′端设计加入NaeI酶切位点,负向引物的5′端加入终止子和BamHI酶切位点,应用DNASIS计算机软件设计下列引物,引物/模板合成由北京三博远志生物技术有限责任公司完成,PAGE纯化。正向引物/模板F:5′CGCCG

8、GCGTGGGAAGAAGTGGAAGATGCGCCGGAATCAGTTCTGGGTAAAGGTAC;负向引物/模板R:5′CGGATCCTCAAAGGAAAGCGCAACCGGACGAATGCTTTCCGCGCTGTACCTTTACC。　　1.2.2cDNA克隆及序列分析使用正、7负向引物进行PCR扩增目的基因,反应条件为:94℃变性60s,37℃退火60s,72℃延伸80s,循环30次,72℃延伸5min。