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1、IFN-γ上调的单核细胞表面MHC-I类链相关分子促进NK细胞活化作者：王惠明,王沂芹,阮志华,傅晓岚,徐文岳,赵婷婷,吴玉章【摘要】 目的:研究IFN-γ诱导上调表达的单核细胞MHC-I类链相关分子(MICs)分子对NK细胞的活化作用。方法:采用密度梯离离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）,以免疫磁珠法从PBMC中特异性分选单核细胞及NK细胞,以细胞因子IFN-γ、TNF-α刺激单核细胞后,再将单核细胞与NK细胞共培养,以流式细胞术（FCM）检测NK细胞表面CD69分子及胞内IFN-γ表达,以51Cr释放试验检测NK细胞对K562细胞的杀伤效应。
2、结果:IFN-γ上调人单核细胞表面MICs表达;IFN-γ刺激的单核细胞能促进异体NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达,能增强NK细胞对K562细胞的杀伤效应;单核细胞的这种效应至少部分依赖于IFN-γ上调的MICs分子,因为用抗MIC抗体封闭或用细胞小室阻断细胞接触,可以明显地抑制NK细胞的活化。结论:IFN-γ上调人单核细胞表面MICs分子介导了NK细胞的活化。【关键词】单核细胞IFN-γMHC-I类相关分子NK细胞 活化的淋巴细胞（含NK、T、NKT细胞）分泌的细胞因子γ干扰素（IFN-γ）不仅具有直接的抗病毒作用,12更具有强大的免疫调节和修饰
3、功能。目前认为,IFN-γ能广泛地作用于体内包括淋巴细胞在内的多种细胞。对于单核细胞,IFN-γ一方面可以影响其向DC或巨噬细胞分化;另一方面,IFN-γ还能诱导单核细胞产生系列细胞因子［1,2］。机体单核细胞正常情况下处于免疫静息状态,但在适宜的条件下,它可以通过转化为DC或者分泌大量细胞因子来参与或调节免疫应答。最近研究发现,单核细胞与NK细胞或T细胞之间存在着对话机制,并且IFN-γ及细胞间的直接接触是介导单核细胞与淋巴细胞相互作用的关键因素［3］。NKG2D是同时表达于人类NK细胞及CD8+T细胞表面的活化受体。对于NK细胞,它直接启动活化信号;
4、对于CD8+T细胞,它提供重要的共刺激信号［4］。MHC-I类链相关分子(MIC)是最早发现并且研究最多的NKG2D受体的配体。MIC是一种应激诱导表达的分子,当细胞处于热休克、氧化、感染等状态时,MIC分子即被诱导表达于细胞表面。细胞表面的MICs作为一种应激“标记”分子,能够被NK细胞或CD8+T细胞表面的NKG2D受体识别,并刺激或共刺激NK细胞或CD8+T细胞活化,最终清除异常细胞。研究发现,MICs分子低水平的表达于某些正常组织细胞如肠上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞表面,单核细胞表面未见MICs表达［5］。NKG2D还在NK细胞、T细胞、DC及
5、其他组织细胞中起着重要的“桥梁”作用［6］。但NKG2D是否也在单核细胞与NK细胞对话中发挥作用？IFN-γ作用的单核细胞是否通过MIC-NKG2D促进NK细胞活化？我们对此进行了探讨。 1材料和方法12 1.1材料FITC标记抗人CD3（OKT3）、CD14（61D3）、CD69（FN50）、IFN-γ（4S.B3）单克隆抗体（mAb）、纯化及生物素化抗人NKG2D(1D11)mAb、PE标记抗人CD56mAb(NCAM)、抗体的各同型对照抗体均购于eBioscience公司;小鼠抗人MICsmAb(clone159207)购于R&D公司;
6、FITC标记的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG二抗购自北京中山生物技术有限公司。小鼠抗人CD14免疫磁珠（CD14MagneticParticles,CloneMфP9）、磁性细胞分离架购于BDBiosciencePharmingen公司;人重组干扰素-γ（IFN-γ）、重组干扰素-α（IFN-α）购自PeProtech公司;人淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）购自天津TDB生物技术发展中心;胎牛血清购自HyClone公司;FACSCalibur流式细胞仪购于BD公司。 1.2方法 1.2.1人PBMCs的分离及单核细胞、NK细胞的分选健
7、康志愿者外周血用生理盐水作等倍稀释后,按标准密度梯度离心法分离PBMCs。单核细胞及NK细胞采取阴性分选和阳性分选相结合的序贯分离法,按说明书操作进行。先从PBMCs中分选CD14+细胞,再从其CD14-组分中去除CD3+细胞,最后从CD3-CD14-组分中分选CD56+细胞,即为CD3-CD56+NK细胞。取少量细胞分别行CD14、CD3/CD56流式细胞术（FCM）检测,12确定CD14+及CD3+CD56-细胞的纯度（>90%）。 1.2.2细胞株培养人红白血病细胞K562由本研究所保存,培养于含100mL/LFCS的RPMI1640完全培
8、养液中。 1.2.3单核细胞/NK细胞共培养纯化的单核细胞按2.5×108个/
