神经肽SP活化NK92-MI细胞相关circRNA、miRNA作用机制的研究

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1、分类号：R392.9单位代码：10159密级：公开学号：201520060硕士学位论文中文题目：神经肽SP活化NK92-MI细胞相关circRNA、miRNA作用机制的研究英文题目：StudyontheMechanismofcircRNAandmiRNARelatedtoNK92-MICellActivatedbyNeuropeptideSP论文作者：张亚南指导教师：梁再赋教授学科专业：医学免疫学完成时间：2018年2月中国医科大学硕士学位论文神经肽SP活化NK92-MI细胞相关circRNA、miRNA作用机制的研究StudyontheMecha

2、nismofcircRNAandmiRNARelatedtoNK92-MICellActivatedbyNeuropeptideSP论文作者张亚南指导教师梁再赋教授申请学位医学硕士培养单位科学实验中心一部一级学科基础医学院二级学科医学免疫学研究方向神经肽SP对NK细胞功能的影响论文起止时间2016年3月—2018年2月论文完成时间2018年2月中国医科大学（辽宁）2018年2月中国医科大学硕士研究生学术论文摘要目的:约占循环淋巴细胞10~15％的NK细胞，不仅能够免疫监视裂解肿瘤、病原体感染的细胞等，也可以分泌细胞因子发挥免疫调节作用，是免疫系统重

3、要的组成部分。真核细胞大量表达miRNA和circRNA非编码RNA，在RNA水平发挥重要的调控作用。与线性RNA不同，circRNA是不含3′或5′端的闭合环状结构，以两种特殊的剪接方式包括反向剪接和套索内含子剪接，由于不受RNA外切酶影响，因此表达稳定不易降解。circRNA的调控功能多样化：①基于海绵作用通过miRNA间接调控目的基因表达；②直接调节RNA，这种作用是通过两者核苷酸之间的碱基互补来实现的；③结合性抑制某些功能蛋白；④合成蛋白，这种作用与普通的外显子编码基因相同。而miRNA是作为mRNA负相调控作用元件来发挥作用的，它在mRN

4、A转录之后可以与靶基因某特殊区域3′UTR结合，抑制相关基因的表达，进而抑制其功能。P物质（SP）作为神经肽已被广泛研究，但其最重要的功能，是作为神经、内分泌、免疫系统三者之间通用生物因子。本实验室一些前期研究表明SP在一定浓度范围内可诱导NK92-MI细胞活化性受体NKRs表达增强，显著增强NK92-MI细胞杀伤和增殖活性。目前，SP参与NK92-MI细胞详细的活化机制在RNA水平包括circRNA和miRNA分子层面研究，国内外尚无报道。本次实验以前期工作为基础，拟利用IlluminaHiSeqTM平台检测并筛选出SP作用NK92-MI细胞前后

5、circRNA的表达。选用生物信息学软件进行预测差异表达circRNA的靶miRNA分子，再进行富集分析。筛选与NK92-MI细胞活化相关的miRNA进行检测，分析其与活化性受体mRNA（NKG2D、NKp46）的表达及杀伤性介质穿孔素mRNA表达的关系，最终确定circRNA和miRNA在SP影响NK92-MI细胞功能的具体环节，为进一步的研究提供依据。研究方法：利用IlluminaHiSeqTM平台检测并筛选SP作用NK92-MI细胞前后circRNAs的差异表达，经qRT-PCR验证后，进行生物信息富集分析；选用qRT-PCR法检测miRNA

6、27a、miRNA30e的表达，生物信息学分析其靶标mRNA；qRT-PCR检测NK92-MI细胞活化性受体NKG2D、NKp46mRNA的表达；流式细胞术检测NK92-MI细胞脱颗粒标志物CD107a的表达及qRT-PCR检测NK细胞杀伤介质穿孔素的表达。结果：（1）SP作用NK92-MI细胞前后筛选出表达下调的circRNA_00027978I中国医科大学硕士研究生学术论文和circRNA_00015274两个分子，qRT-PCR法进行验证，与IlluminaHiSeqTM平台检测结果一致。SP作用NK92-MI后，检测出差异表达的基因共54个

7、，差异表达的转录本共有28个，全部为下调表达。（2）生物信息学预测结果显示circRNA_00027978调控的miRNA共1245个，circRNA_00015274调控的miRNA共880个，根据预测与文献查询，我们筛选对miRNA27a、miRNA30e进行进一步研究。（3）SP刺激NK92-MI细胞后可导致miRNA27a、miRNA30e表达下降，生物信息学预测miRNA27a的靶标基因共959个，miRNA30e的靶标基因共1182个。（4）SP刺激NK92-MI细胞后可导致活化性受体包括NKG2D、NKp46mRNA表达明显升高。（5

8、）静息状态NK92-MI细胞表面几乎不表达或表达微量的CD107a分子，加入SP刺激后，明显增强CD107a分子及杀伤介质