NK细胞活化性受体NKp30的表达与功能研究

《NK细胞活化性受体NKp30的表达与功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、作者姓名：学科专业：导师姓名：完成时间：王宏伟细胞生物学孙、衲教授二O一一年五月UniversityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationfordoctor’SdegreeExpressionandFunctionalResearchofActivatingReceptorNKp30onNKcellsAuthor’SName：●●-speciality：一●Superwsor：11●●tlnishedtime：HongweiWangCellbiologyProf．RuiSunMay,2011—。。_——中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明

2、所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特，l,J)JI以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：衅签字日期：!!!-鸟i钰中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交

3、的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。弋压开口保密!——年)作者躲墨醴签字日期：』至!』上6-矛导师签名：签字日期：皇!!!：堡：星。。。。。。——摘要摘要固有免疫(innateimmunity)是生物体在物种进化过程巾形成的··系列防御机制，能迅速的对侵入的病原体产生非特异性抗感染免疫应答，同时固有免疫在适应性免疫应答过程中也起着重要作用。天然杀伤细胞(naturalkillercells．NK)是固有免疫系统的重要组成部分，在机体防御病原微生物感染和抗肿瘤方面发挥着重要的作用。NK细胞的活化受其表面活化性与抑制性受体的协同调控，自然细胞毒性受体(n

4、aturalcytotoxicityreceptors，NCRs)是NK细胞特有的活化性受体，通常在NK细胞表面抑制性受体丧失识别“自我”能力时，发挥杀伤作用。NKp30(NCR3)是NCR家族的⋯个重要成员，表达于所有NK细胞表面，在NK细胞活化以及杀伤肿痛的过程中发挥重要作用，近几年研究表明，NKp30分子参与NK细胞与树突状细胞(dendriticcells，DC)的交互调节(crosstalk)，实现对固有免疫和适应性免疫的调控。NKp30分子的功能在过去lO年里得到了研究者广泛的关注，但NKp30分子在NK细胞的活化及免疫突触形成中的确切作用机制尚不清楚。本研究中，我们构建了人N

5、Kp30胞外段结构域原核细胞表达载体，狱得有生物学活性的NKp30重组蛋白。我们采用NKp30重组蛋白免疫小鼠，制备了抗NKp30的单克隆抗体。我们利用免疫荧光、51Cr同位素释放实验、流式细胞术(FACS)和免疫印迹(Westernblotting)实验对NKp30分子存NK细胞活化及NK细胞免疫突触形成中的作用进行了研究。主要取得了以下结果：。1，NKp30分子胞外段结构域蛋白的表达与纯化构建NKp30胞外段结构域蛋白的原核细胞重组表达载体，通过诱导表达，重组蛋白以包涵体形式存在，经过Westernblotting$1]质谱鉴定，目的蛋白为人NKp30重组蛋白(简称rhNKp30)。分

6、别采片j稀释复性法和镍柱亲和层析法对rhNKp30进行复性和纯化，蛋白纯度可以达到95％以上。经FACS检测rhNKp30能够与NKp30配体阳性细胞结合，51Cr释放实验结果显示rhNKp30能够抑制NK92细胞对Hela细胞的杀伤。结果提；；j÷rhNKp30具有生物学活性，可用于功能研究。2，抗人NKp30单克隆抗体的制备、鉴定及应用用rhNKp30免疫8．10周龄的BALB／c雌性小鼠，采取不同的免疫策略，经过5次免疫后，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤SP2／0细胞在聚乙二醇作用’卜．进行体外融合。通过有限稀释法和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞株，共狭得T4株能稳定

7、分泌抗rhNKp30的单克隆抗体杂交瘤细胞株。我们选择了其中对NKp30亲和力高的克隆号为3G5的单克隆抗体进行了深入研究。常规方法制摘要备腹水，经ProteinG亲和层析法纯化获得纯度为95％的单克降抗体3G5，并对该抗体进行了特性鉴定和应用检测。单克隆抗体3G5n⋯匕广泛用于Westernblotting、免疫沉淀(1mmunoprecipitation)、ELISA和FACS检测实验，并月．单克隆抗体3G5彳i影n