crd-bp rna表达与结直肠癌临床特征相关性分析

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1、CRD-BPRNA表达与结直肠癌临床特征相关性分析作者：金晓菲，尹莉，陈官民，王小娟【摘要】：为了解结直肠癌患者外周血中不稳定编码区结合蛋白（CRD-BP）RNA的表达与患者临床特征的相关性，应用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应方法检测32例结直肠癌患者和35例对照组人群外周血中CRD-BPRNA的表达。结果结直肠癌组32个样本中有10个样本中检测到CRD-BPRNA表达，阳性表达率31.25%，对照组35个样本中均未检测到CRD-BPRNA表达，两组间阳性表达率差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组中C

2、RD-BPRNA的表达与临床分期及有无淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。结直肠癌患者外周血中CRD-BPRNA表达可能与有无淋巴结转移、临床分期相关。【关键词】CRD-BPRNA；外周血；直肠癌结直肠癌在全球发病率居第三位、死亡率居第4位［1］。近年来不稳定编码区结合蛋白（CodingRegioninstabilityDeterminant-BindingProtein，CRD-BP）成为肿瘤学研究的热点。已有研究表明CRD-BP在结直肠癌等多种肿瘤中表达，研究其表达与直肠癌临床特征相关性可以为临床诊断

3、、治疗、判断结直肠癌预后提供帮助。11　　1材料与方法　　1.1对象和分组结直肠癌患者32例（实验组），男18例，女14例，年龄36～83岁，平均62岁。肿瘤病理类型：根据Dukes分期标准进行临床分期：DukesA期7例、DukesB期13例、DukesC期10例、DukesD期2例。分化程度：高分化腺癌9例、中分化腺癌16例、低分化腺7例。术后确定肿块直径≤5cm18例、＞5cm14例。术后确定有淋巴结转移12例、无淋巴结转移20例。所有标本均来源于宁夏医科大学附属医院，用EDTA.Na2抗凝管采清晨

4、空腹静脉血5mL。　　对照组共35例，均选取宁夏医科大学附属医院2006年1月－2006年4月门诊就诊者，其中健康体检者20例，经肠镜活检确诊良性肠道疾病者15例。男18例，女17例，年龄分布22～56岁，中位年龄37岁。　　1.2引物、探针的设计与合成　　CRD-BPRNA引物参照Ross资料设计［2］，采用计算机软件辅助设计，根据引物的设计原则，设计扩增的CRD-BP11RNA引物序列为：外引物：上游引物：5’-ATCACTGTGAAGGGGGCCAT-3’（20bp），下游引物：5’-AGCTATA

5、GGGAGCAGCCCCAG-3’（21bp）；内引物：上游引物：5’-GAATGATGTGGCTGCCATGA-3’（20bp），下游引物：5’-GACCTACAGCAGCCAGGTTCA-3’（21bp）。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。按照荧光定量PCR探针设计要求，设计荧光定量PCR扩增HCV的探针序列为：5’-FAM-CCTGCAGTCTCACCTGATCCCTGGC-TAMRA-3’（25bp），其中5’标记的荧光发光基团是6-羧基荧光素，3’标记的荧光淬灭基团为四甲基罗达明，探针的合成及

6、5’端标记在中山大学达安基因诊断中心实验室PE394仪上合成，随后进行3’端标记及封闭。探针的纯化采用15%聚丙烯凝胶电泳后割胶分离纯化，纯化后的探针测定其OD值，计算其含量，置-20℃备用。　　1.3RNA的提取　　用淋巴细胞分离液（北京鼎国生物制品公司）自静脉血中分离单个核细胞，采用Trizol（北京鼎国生物制品公司）总RNA提取液“一步法”提取细胞总RNA，加入20μL无RNase水中溶解，取5μLRNA置紫外分光光度计测OD260、OD280及二者比值，计算RNA浓度。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测R

7、NA完整性。　　1.4逆转录反应和PCR扩增11　　各管总反应体积20.0μL。取5μLRNA加入5×逆转录buffer4.0μL，外上游引物0.4μL，外下游引物0.4μL，dNTPs0.2μL，逆转录酶MMLV（20u/μL）1.0μL，DEPC水9.0μL。反应条件：37℃反应60min，然后95℃灭活3min。　　1.5PCR扩增　　取逆转录产物（cDNA）5.0μL加入5×定性PCRbuffer5.0μL，外上游引物0.5μL，外下游引物0.5μL，dNTPs0.3μL，Taq聚合酶（3u/μL

8、）1.5μL，逆转录产物（cDNA）5.0μL，ddH2O12.2μL。93℃变预性2min，在PE9600扩增仪（美国ABI公司）中93℃45，55℃30s，2℃45min，72℃min共20个循环。取cDNA（第一轮PCR产物）5.0μL加入5×定量PCRbuffer10.0μL，内上游引物1.0μL，内下游引物1.0μL，dNTPs0.5μL，荧光探针1.0μL，Taq聚合酶（3u/μL）1.5μL，ddH2O30.0μ