e3泛素连接酶hectd3真核表达质粒的鉴定

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1、E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的鉴定　　摘要：目的鉴定E3泛素连接酶（homologoustotheE6-associatedproteincarboxylterminusdomaincontaining3，HECTD3）基因的真核表达质粒。方法提取无内毒素真核表达质粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine2000将其转染进卵巢癌细胞SKOV-3细胞，qRT-PCR法和蛋白质免疫印迹技术检测该基因的表达情况。结果真核表达质粒pcDNA-HECTD3可以显著地提高HECTD3基因在mRNA和蛋白水平的表达量。结论HECTD3基因的真核表达质粒构建成功，可以

2、用于后续卵巢癌发生发展的分子生物学研究。　　关键词：E3泛素连接酶；卵巢癌；真核表达质粒　　卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，仅2011年1年就导致全世界140000人死亡[1]。HECTD3（homologoustotheE6-associatedproteincarboxylterminusdomaincontaining3）是一个功能目前尚未阐述清楚的新的E3泛素连接酶[2]。有报道指出该基因可能在乳腺癌和宫颈癌中介导顺铂的化疗耐受[3]，但尚未有人报道HECTD3在卵巢癌中的作用。实验室前期构建该基因真核表达质粒pcDNA-HECTD3，本研究将鉴定该真核表达质粒在胞内对

3、HECTD3基因表达情况的影响，为进一步研究HECTD3基因在卵巢癌发生发展中的作用提供有力的工具和手段。　　1实验材料　　卵巢癌细胞SKOV-3和真核表达质粒pcDNA-HECTD3由本室保存。Trizol、Lipofectamine2000购自美国invitrogen公司，RPMI-1640、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司。逆转录试剂盒cDNASynthesisKit（M-MLVVersion）、SYBR○RPremixExTaqII（TiRNaseHPlus）购自TaKaRa公司。Endo-freePlasmidExtractionKitII购自omega公司，细胞裂

4、解液购自碧云天，蛋白酶抑制剂cocktail购自Roche公司。Anti-HECTD3鼠多抗、anti-β-actin鼠单抗、辣根过氧化酶偶联的鼠二抗购自abcam公司，ECL化学发光试剂盒购自millipore公司。引物由invitrogen公司合成。　　2实验方法　　2.1qRT-PCR提取无内毒素质粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine2000将其转染进卵巢癌细胞SKOV-3，24h后提取细胞总RNA，并将其逆转录为cDNA，此为qRT-PCR模板。内参Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）上游引物序

5、列：5'-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3'，下游引物：5'-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3'；HECTD3的上游引物：5'-CAGGCAGGTCTGCTGAAGGT-3'，下游引物：5'-CGAGTCAGATGGCTCGAAGT　　C-3'。qRT-PCR反应体系如下：SYBR10μL，ForwardPrimer0.8μL，ReversePrimer0.8μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，DNA模板100ng，用双蒸水补至20μL体积。qRT-PCR反应条件如下：95℃30s，95℃5s，60℃30s（40个循环）40

6、℃1min。实验重复3次，用SPSS19.0软件包进行统计学分析。　　2.2蛋白质免疫印迹提取无内毒素质粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine2000将其转染进卵巢癌细胞SKOV-3，48h后提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后电转移至PVDF膜上，置于5%脱脂奶粉中室温封闭2h，室温孵育一抗2h（HECTD3，1∶500；β-actin，1∶5000），TBST洗3次×15min，分别加入辣根过氧化酶偶联的鼠二抗（1∶10000），室温孵育1h，TBST洗3次×15min，化学发光试剂盒ECL显色。　　3实验结果　　利用qRT-PCR技术检测HECTD3在卵

7、巢癌细胞中的mRNA水平的表达情况，见图A。由图可以看出，转染了表达质粒pcDNA-HECTD3的细胞中HECTD3在mRNA水平的表达量是对照组的3.489倍，且P<0.01。同时采用免疫印迹技术检测HECTD3蛋白在两种细胞中的表达量变化，见图B。可以看出，转染了pcDNA-HECTD3质粒的细胞中HECTD3蛋白表达丰度较对照组明显提高。由此说明，我们成功构建了HECTD3基因的真核表达质粒，且将该质粒转染进卵巢癌SKOV-3细胞之后能够在mRNA水平和蛋白水平显著地提高该