HBeAg阴性血清中乙肝病毒前C区变异分析.doc

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1、HBeAg阴性血清中乙肝病毒前C区变异分析作者：郭龙华，黄宪章，庄俊华【关键词】,乙型肝炎病毒；变异；前C基因【摘要】目的了解本地区乙型肝炎病毒（HBV）流行株前C（PreC）基因的变异，为临床提供诊疗信息。方法通过设计2条特异性引物进行PCR扩增病人血清中PreC基因序列，回收PCR产物直接进行DNA测序和比对分析。结果PreC变异主要集中在nt1896位G→A。结论PreC变异可使HBeAg阴转。　　【关键词】乙型肝炎病毒；变异；前C基因　　AstudyonthemutationsofprecoregeneofhepatitisBvi

2、rusgenomeineantigen-negativesera　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatethemutationsofprecoregeneintheeantigen-negativeseraofpatientswithhepatitisBvirus（HBV）infectionandprovideinformationfordiagnosisandremedyofthediseases.MethodsPrecoregenewereamplifiedbyheminested-PCRfromeanti

3、gen-negativeseraandeantigen-postivesera，andthePCRproductsweresequenced，andthesequenceswereanalysed.ResultsTherewasahotpointmutationinnucleotideposition1896G→Ainprecoregene.ConclusionThemutationsinprecoregeneancauseeantigenseroconversion.　　【Keywords】hepatitisBvirus;mutatio

4、n;precoregene乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）是不完全双链环状DNA病毒，基因组全长约3.2kb，为目前已知对人类致病的最小DNA病毒。HBV复制过程中要经过逆转录，由于逆转录酶缺乏有效的碱基校对功能，故HBV基因组比一般DNA病毒易发生变异。这给疾病的预防、诊断、治疗和预后带来新的问题。有关HBV基因组的变异，近些年来一直是人们研究的热点。　　过去认为乙肝病毒e抗原（HBeAg）阴转，表明病情向好的方面发展。研究证明，如果体内还有HBV在复制，HBeAg阴转往往是HBV在体内发生变异的结果，易使疾病慢性

5、化。HBVPreC基因定位于乙肝病毒基因组nt1814-1900，PreC由于突变，提前出现终止子，HBeAg合成提前终止，影响干扰素疗效［1］。PreC是高变区，研究PreC的变异具有重要的临床意义。　　1材料与方法4　　1.1材料　　1.1.1血清标本　　来源于我院门诊和住院病人。　　1.1.2主要仪器　　Roche公司LightCycler型荧光定量PCR仪、飞鸽牌TGL-16B台式高速离心机。　　1.1.3主要试剂　　广州达安基因公司HBVDNA荧光PCR定量检测试剂盒、蛋白酶K（Merck公司）、平衡酚（国产），裂解液（自配）。

6、TaqDNA酶（MBI公司）、dNTP（Promega公司）、PCR产物直接回收试剂盒和DNAMarker（北京天为时代公司）。　　1.1.4引物　　参照GenBank中的HBV基因组序列，用PrimerPremier5.0软件设计2条特异性引物（半巢式PCR）：正义引物P1:5′-GACTCTCAGCAATGTCAACG-3′（nt1669-1688）；反义引物P2:5′-TCATCAACTCACCCCAACAC-3′（nt2099-2080）；由北京三博远志生物公司合成。设计PCR终产物431bp。　　1.2方法　　1.2.1标本采集

7、　　收集30例HBeAg阴性标本（HBVDNA含量3.0×103~3.1×105copies/ml）和5例HBeAg阳性标本（HBVDNA含量都高于5×105copies/ml，用于对照）。　　1.2.2HBVDNA的提取　　方法参照文献［2］。　　1.2.3PCR扩增　　10×缓冲液5μl，P1、P2（5μmol/L）各2μl，dNTP（10mmol/L）1μl，TaqDNA酶（1U/μl）1μl，MgCl2（25mmol/L）3μl，模板6μl，ddH2O30μl。加石蜡油30μl，94℃5min。然后94℃1min，53℃1min，

8、72℃1min共循环35次，72℃延伸5min。　　1.2.4结果的观察及回收4　　取第二轮PCR产物在1.2%琼脂凝胶（含EB）上电泳，观察结果。用试剂盒直接回收剩余PCR产物。回收的PCR