实验六 放线菌素d诱导细胞凋亡形态学观察

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1、实验六、细胞凋亡的诱导及观察2002年10月7日,瑞典卡罗林斯卡医学院诺贝尔奖评审委员会将2002年诺贝尔生理学或医学奖授予了悉尼·布雷内、罗伯特·霍维茨和约翰·苏尔斯顿三位科学家,以表彰他们在“细胞程序性死亡”这一领域中的开创性工作。他们不但发现在生物的器官发育过程中存在细胞程序性死亡,而且阐明了细胞程序性死亡过程中的基因规律。实验目的1.了解细胞凋亡的原理2.学习离体诱导细胞凋亡的方法2.掌握利用普通显微镜和荧光显微镜观察凋亡细胞形态的方法一、细胞死亡(celldeath)定义:细胞生命现象不可逆的停止,分为两种形式,即坏死性死亡和程序性死亡。1.

2、坏死性死亡(necrosis)定义:细胞外部的化学、物理或者生物的因素的侵袭而造成的细胞崩溃和裂解,是被动的死亡。2.程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)定义:细胞在一定的生理或者病理条件下按照自身的程序结束其生存,是细胞接受指令后进行的主动性死亡,涉及一系列基因的激活、表达和调控。受内在遗传机制的控制主动结束生命的过程。程序性死亡主要包括细胞凋亡(apoptosis)和细胞自噬(autophage),2.1细胞凋亡(apoptosis)定义:是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动死亡过程.凋亡细胞将被邻近的细胞

3、或吞噬细胞所吞噬并消化2.2细胞凋亡诱导因素内源性因素;内源性的因素包括细胞凋亡诱发机制(如Fas配体、肿瘤坏死因子等)的激活和抑制机制(生长因子、激素、受体因子等增殖性因子)的失活。外源性的因素;外源性的因素包括放射线、热休克等物理性因素,药物、毒物等化学性因素以及病毒、细菌等生物学因素。2.3细胞凋亡的生物学特征形态学特征生物化学特征DNA片段化大分子的合成tTG(组织转谷氨酰胺酶)的积累并达到较高的水平。形态学特征细胞变圆、胞质皱缩,细胞体积减小,染色质凝聚,核碎裂成为染色质块(核碎片)。整个细胞通过发芽、起泡等方式产生一些球形突起,并在基部脱落

4、形成大小不等的、内含胞质、细胞器和核碎片的凋亡小体(apoptoticbody)。凋亡的起始:细胞表面的特化结构如微绒毛消失,细胞间接触的消失,但细胞膜依然完整;线粒体大体完整,但核糖体逐渐从内质网上脱离,内质网囊腔膨胀,并逐渐与质膜融合;染色质固缩,形成新月形帽状结构等形态,沿着核膜分布凋亡小体的形成:核染色质断裂为大小不等的片段,与某些细胞器如线粒体一起聚集,为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起,逐渐形成单个的凋亡小体凋亡小体逐渐为邻近的细胞或吞噬细胞所吞噬并消化。细胞凋亡过程的3个阶段坏死凋亡形态学特征膜完整性丧失胞浆和线粒体

5、膨胀全细胞裂解胞膜出芽,但保持完整染色体聚集在核膜周边胞浆收缩、细胞核凝集最后细胞分裂为凋亡小体Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加生化特征离子内环境失调非能量依赖性的(被动过程,在4°C也可以发生)随机消化DNA(电泳显示为DNA弥散状态)PostlyticDNA断裂ATP依赖性的(主动过程,在4°C不能发生)以核小体为单位剪切DNA(电泳显示为DNAladder)PrelyticDNA断裂线粒体释放多种因子至胞浆中(细胞色素c、AIF)Caspases级联活化膜对称性改变(PS外翻)生理学特征影响群组细胞由非生理学因素引起(如补体攻击、代谢中毒

6、、缺氧等)被巨噬细胞吞噬周围有明显的炎症反应只影响单个细胞由生理学刺激诱导(如生长因子缺乏、激素环境改变等)被临近细胞和巨噬细胞吞噬无炎症反应细胞的两种死亡方式及比较细胞凋亡的形态学检测1光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,呈新月状附在核膜周围。2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有:HO,Hoechst33342;HO,H

7、oechst33258;DAPI;吖啶橙。3电子显微镜观察DAPI4,6-联脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)可以穿透活细胞膜,对活细胞无毒副作用与双链DNA结合产生比DAPI自身强20多倍的荧光与单链DNA结合后,荧光不增强λex340 nm;λem488 nm(nurDAPI)λex364 nm;λem454 nm(DAPI-DNA-complex)(蓝光)优点:结合力强,荧光强且稳定缺点:自身有荧光,背景高。致癌NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapopto

8、sisprocessbyusingDAPIHoechstHoechst是一种水溶性双苯咪唑类化

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