放线菌素d2ftnfα诱导小鼠胰岛微血管内皮细胞凋亡研究论文

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1、硕士学位论文放线菌素D／TNF．仅诱导小鼠胰岛微血管内皮细胞凋亡的研究硕士研究生：湛奕指导教师：蔡德鸿教授摘要研究背景胰岛是高度血管化的微器官，胰岛微血管内皮细胞(isletmicrovascularendothelialcells，IMEC)是胰岛微血管的主要组成部分，不仅具有血管内皮细胞的一般性质，如血管生成、止血的作用，而且担负着营养B细胞、分泌诱导胰岛细胞生长发育信号分子的功能。既往已有研究证明，p细胞功能衰竭很可能是胰岛微血管病变的表现【21，而过量的IMEC凋亡是引起胰岛微血管病变的重要因素。正常的情况下，血管内皮细胞的凋亡与生成处于一个动态平衡的状态，但长期处于一种

2、慢性的低度亚临床炎症状态的2型糖尿病患者，尤其发生酮症酸中毒、急性感染时，短时间内启动炎症级联反应，导致胰岛微血管内皮细胞大量凋亡，从而破坏动态平衡，抑制了血管的生成，最终导致B细胞损伤。据此，深入研究胰岛内皮细胞病理生理改变的机制，建立有效阻断损伤通路的途径，对于保护胰岛细胞，阻止糖尿病的发生发展具有积极意义。近年来炎症病因学理论倍受关注。该理论认为，2型糖尿病(T2DM)是一种低度炎症性疾病。炎症已成为T2DM的一种重要发病机制，炎症与T2DM之间的关系已成为近十年来国际研究的一个热点。大量证据表明，在炎症．胰岛素抵抗．2型糖尿病的病理生理过程中，脂肪组织的分泌功能紊乱扮演了

3、重要角色。肿瘤坏死因子．Q(tumornecrosisfactoralpha，TNF．a)是炎症因子，也是脂肪源性的细胞因子之一，被认为是参与胰岛素抵抗(InsulinResistance，IR)并最终导致2型糖尿病发生的重要因素。中文摘要TNF．Q是具有广泛生物学活性的细胞因子。TNF．Q可直接或间接诱导细胞凋亡，通常认为TNF．0【的细胞学效应主要由TNFRl介导。TNFRl能激活凋亡通路，导致细胞凋亡。血管内皮细胞表面存在TNF．a受体，故血管内皮细胞也是TNF-a作用的靶细胞。在原代培养的牛血管内皮细胞中加入TNF．a，出现大量的细胞凋亡，并存在剂量和时间效应关系。在T2

4、DM这种慢性低度炎症状态之下，有微血管病变的2型糖尿病患者出现血管内皮细胞凋亡的现象与血清中存在高浓度TNF吨密切相关。内皮细胞的损伤又促使IL．1和TNF．Q的释放，再次加重血管内皮细胞的损伤，两者互为因果，形成恶性循环。’此外，有学者发现TNF．Q可通过死亡受体、氧化应激等途径导致胰岛p细胞凋亡。有研究发现TNF．a所引起的血管内皮细胞凋亡与c嬲p嬲e．8及c船p嬲e．3的作用有关。随后Chang等报道，TNF-a可通过线粒体途径激活caSp嬲e．9、3、7，产生同样的生物学效应。以上研究结果说明TNF．a可通过多种途径导致内皮细胞与13细胞的损伤与凋亡。许多实验显示，加用R

5、NA合成抑制剂放线菌素D(ActinomycinD，ActD)或蛋白质合成抑制剂放线菌酮，可使原来对TNF．a细胞毒作用不敏感的细胞出现凋亡，或使对TNF．a敏感的细胞出现更强的凋亡效应。为了更好地观测炎症起始细胞因子TNF．a、放线菌素D／TNF．a对IMEC的影响，以及IMEC上TNFRl的表达和阻断凋亡通路的机制，本试验在建立小鼠IMEC凋亡模型的基础上，以小鼠IMEC为研究对象，探讨炎症因子与胰岛微血管内皮细胞凋亡的关系，以期为防治糖尿病提供新的实验依据。目的研究肿瘤坏死因子1型受体(TNFRI)在小鼠IMEC上的表达，观察TNF．口，ActD／TNF-a刺激对IMEC的

6、作用及其可能的损伤机制，建立小鼠IMEC的凋亡模型，为干预糖尿病及寻找新的治疗靶点提供实验依据。方法1．以美国国立细胞库(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)MS．1细Ⅱ硕士学位论文胞作为试验对象进行培养和诱导凋亡。将MS．1细胞置于含5％新生牛血清的高糖DMEM培养基中，37"C、5％C02饱和湿度下培养。细胞贴壁生长，铺满后以0．25％胰酶消化传代，每3d传代1次。2．细胞爬片及免疫荧光染色：细胞经消化后，用含5％新生牛血清的培养基将细胞调成的细胞悬液，接种于6孔板中，待细胞生长状态良好时终止培养。4％多聚甲醛固定爬片30min后PBS冲洗，

7、用0．1oATritonX．100处理后以正常羊血清工作液封闭，倾去血清，滴加一抗即兔抗鼠TNFRl多克隆抗体，过夜后滴加二抗即FITC标记羊抗兔IgG，室温孵育2h。封片后在荧光显微镜下观察、拍照。3．透射电镜观察：将细胞随机分为3组：①正常对照组、②TNF．a组(TNF．a终浓度为100ng／ml，以下括号内浓度均指终浓度)、③ActD／TNF—Q组(毛E20ng／mlActD预处理15rain后再加入TNF．a)。细胞经药物作用24h后，再用胰酶消化、PBS洗涤、离心、弃上