放线菌素D诱导细胞凋亡形态学

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1、放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察【实验目的】观察凋亡细胞的形态变化。【实验原理】细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（programmedcelldeath,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。细胞死亡有两种形式：一种是坏死性死亡（necrosis），是由于细胞外部理化因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解；另外一种是凋亡（apoptosis），是细胞在一定的生理或者病理条件下按照自身的程序结束其生存，是由基因决定的自动结束生命的主动过程，由于受到严格的遗传机制决定的程序性调控，所以也被称为细胞程序性死亡(programmedce

2、lldeath，PCD）。生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体的胚胎发育、维持器官组织细胞数目相对平衡、自我平衡的保护以及抵御外界因素的干扰都起着非常关键的作用：蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡，脊椎动物的神经系统的发育，发育过程中手和足的成形过程。诱导细胞发生凋亡的外在因子包括物理性因子（如紫外线、γ射线等）和化学性因子（如超氧自由基、羟自由基、视黄酸、环己亚胺、放线菌素D等）。细胞凋亡过程不同于坏死性死亡，凋亡过程中染色质断裂，细胞核碎裂成为核碎片，细胞质浓缩，细胞体积减小，细胞膜内折，整个细胞通过起泡和发芽的方式形成一些大小不等的凋亡小体（apoptoticbodies），并逐渐被细胞

3、周围的吞噬细胞所吞噬，细胞的内容物没有泄漏，不会引起周围组织的炎症反应。凋亡细胞的核DNA的断裂发生在核小体之间，因此产生的断裂DNA在电泳时会呈现180～200bp整数倍大小的阶梯状条带（ladders），这是识别凋亡细胞的可靠生化特征。Hochest33258荧光染料能够和DNA特异结合，对正常细胞、凋亡细胞均能染色，受到紫外光激发可发出绿色荧光。但由于凋亡细胞的染色质凝缩和凋亡小体的形成，因此呈致密浓染，而正常细胞则发出均匀荧光，由此可以将凋亡细胞和正常细胞区分开来。诱导细胞凋亡步骤1、向处于对数增长期细胞加入放线菌素D（1μg/ml），细胞37℃培养箱中培养12小时；2、将培养瓶中的培

4、养基和悬浮细胞收集到离心管中，2000rpm离心8-10分钟去上清收集细胞；用胰酶消化培养瓶中的贴壁细胞，再合并到离心管中，再离心收集细胞。3、加入2mlPBS悬浮细胞，离心去上清；再加入0.1ml固定液悬浮和固定细胞10分钟。4、取2滴细胞于洁净的盖玻片上，自然干燥；5、置盖玻片于平皿内，滴加Hochest33258染液，室温下避光染色20－30分钟后，蒸馏水洗涤3次，自然干燥。6、在载玻片上滴一滴封片液，将盖玻片有细胞的一面封盖在液滴上，不要产生气泡，用滤纸吸去多余的封片液。7、在荧光显微镜下进行观察。（染色时看上次结果）【观察与结果】Hela细胞经过放线菌素D诱导后，可产生不同程度的细胞

5、凋亡。在荧光显微镜下，被Hochest33258染色的正常细胞呈现均匀的蓝色，而凋亡细胞表现为团状分布的致密浓染颗粒，二者区别明显。显示细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker（自赵允、翟中和）DNA鉴定（不作）长成致密单层细胞诱导后收集细胞,用PBS洗3次。加入细胞裂解液37℃温育过夜,离心收集上清,苯酚、氯仿抽提,在上清液中加入2倍体积乙醇在-20℃静置过夜,离心,DNA沉淀用TE溶解，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。细胞凋亡(Apoptosis)●细胞凋亡的概念

6、及其生物学意义●细胞凋亡的形态学和生物化学特征●细胞凋亡的分子调控机理一、细胞凋亡的概念及其生物学意义●概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（programmedcelldeath,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。●生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用：蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡，脊椎动物的神经系统的发育，发育过程中手和足的成形过程。二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征●细胞凋亡与坏死(necrosis)●细胞凋亡的形态学特征●细胞凋亡的生化特征●诱导细胞

7、凋亡的因子●细胞凋亡的检测细胞凋亡与坏死(necrosis)●二者的主要区别是，细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptoticbodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎