hsp70在放线菌素d诱导a549细胞凋亡中的作用

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterRoleofHSP70intheApoptosisofA549CellsInducedbyActinomycinDByPengHuiSunSupervisor：Prof．FangZhouProf．YiMingWuDepartmentofoccupationalandenvironmentHealthScienceCollegeofPublicHealthJune，2012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研

2、究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位做慌三小晰嗍如懈钼f≥日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本

3、人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文懈椭辉吼2D／埠绷徊摘要背景：肺癌作为一种原发性的恶性肿瘤，它在中国的发病率和死亡率正呈现逐年上升趋势。因此对于肺癌发病机制的研究，以及一些针对肺癌的某些抗肿瘤疗法的建立，正逐渐成为生命科学研究的热点。JNK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶通路的一种，它主要介导细胞外的信号传递到细胞内部，启动凋亡程序，从而引起细胞凋亡。热休克蛋白(heatshockproteins，HSPs)又被称为热应激蛋白，它是由于机体受到内外各种因素刺激

4、而产生的一类高度保守的蛋白质。它的生物学功能主要有参与维持细胞内蛋白的空间构象，促进蛋白质的折叠加工和转运，以及分子伴侣功能等。HSP70是热休克蛋白蛋白家族的一个重要成员，研究发现它与肿瘤的发生、发展，以及耐药性的发生以及预后都有极其重要的关系。有研究表明HSP70在肿瘤组织中高表达，参与了肿瘤的发生发展过程，并与肿瘤的增殖情况和恶变程度密切相关。Hee．saePark等的研究表明HSP70能抑制YNK的活化，从而影响c-jun氨基末端激酶凋亡信号转导通路的作用，参与细胞凋亡。该课题拟使用放线菌素D作为染毒剂作用于肺腺癌细胞株A549建立一个凋亡诱导模型

5、，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，蛋白质印迹(Westernblot)法检测HSP70和磷酸化JNK的表达，对HSP70在通过JNK通路对A549细胞凋亡的影响机制进行研究，为通过阻断HSP70的抗凋亡作用来治疗肿瘤这一方案提供一定的实验基础和理论依据。研究目的：HSP70的高表达是否能引起放线菌素D(actinomycinD，ActD)诱导的细胞凋亡率发生变化，如果发生变化，则可探索HSP70引起这种变化的可能的作用机制。材料与方法：1．染毒浓度的确定：使用MTT法检测不同浓度的ActD染毒的各组细胞的活性。取对数生长期的细胞，消化下来以后重悬细胞，调整细

6、胞浓度为5x104个／mi，转移到96孔板中，每孔200lal，5％C02，37。C孵育至细胞铺满96孔板底部。吸取培养液，分别加入终浓度为(0、5、lO、20、40、60、80、160)“g／ml的放线菌素D(actinomycinD)(以培养液作为溶剂配制出所需的ActD的相应浓摘要度)，l组为溶剂对照组(仅加l％DMSO)。每组设5个平行孔，继续培养12h，PBS冲洗2~3次，每孔中加入5mg／ml的MTT染液201al，放入培养箱中继续培养3h，弃去培养基，每孔加入DMSO100乩’放入摇床中室温震荡10rain，酶联免疫检测仪检测各组在492nm

7、处的吸光度值，然后根据公式计算细胞的致死率，根据结果确定染毒剂量。2．实验分组：采用放线菌素D(ActD)作为凋亡诱导剂，将A549细胞分为4组：①正常对照组：②ActD染毒组；③肿(抑制剂SP600125+AetD组；④热处理+ActD组。3．检测细胞凋亡率：采用AnnexinV-FITC和碘化丙碇双染法对细胞进行染色，完成后，上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。4．westernblot法检测HSP70蛋白和p-JNK蛋白的表达：将各组细胞取出，蛋白抽提试剂盒提取各处理组细胞的总蛋白；然后经过SDS．PAGE凝胶电泳、转膜、抗体孵育、ECL显色，最后使用

8、Geipro4软件分析2种蛋白的相对表达量，进行相关性分析。5．所