鸡血细胞凋亡的诱导、形态学观察和DNA梯状条带检测.doc

《鸡血细胞凋亡的诱导、形态学观察和DNA梯状条带检测.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、鸡血细胞凋亡的诱导、形态学观察和DNA梯状条带检测姓名：王心茹班级：09级生科4班学号：200900140124【实验目的】1、了解细胞凋亡的概念和原理。2、掌握细胞凋亡诱导的方法。3、观察细胞凋亡和细胞坏死的形态学特征。4、掌握细胞凋亡与细胞坏死的区别。【实验原理】细胞凋亡也称程序性细胞死亡。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，山基因控制的细胞门主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是-•件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一-种现象，而是

2、为更好地适应生存环境而主动争取的一•种死亡过程。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起看必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制°细胞坏死是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，瑕后细胞破裂。另外坏死的细胞裂解耍释放出内含物，并制引起

3、炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。图1细胞凋亡细胞凋亡的形态学特征变化：形态熔观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表而，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为儿个凋亡小体，无内容物外溢，因此不

4、引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非帘特并并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的報倍数，而这止好是缠绕纽蛋门寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断,产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明，这种DNA的有控降解是--种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解农现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥

5、漫的连续图谱。细胞凋亡的形态学检测：根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1光学显微镜和倒置显微镜(1)未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴庶细胞出现皱缩、变圆、脱落。(2)染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割。成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜-•般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有:H0

6、33342(Hoechst33342),HO33258(Hoechst33258),DAPL三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸绸水配成lmg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2-5mg/mLDAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色八储存液用蒸帑水配成lmg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5~lmg/mlo结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：【期的细胞核呈波纹状(r

7、ippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；Ila期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；IIb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3透射电子显微镜观察结果评判:凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡［期(pro-apoptosisnuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，岀现许多称为气穴现彖(cavitations)的空泡结构；Ila期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。【实验材料】鸡血细胞【实验试剂】0.85%的生理盐水,20mmol/LCaCI2顺钳,姬

8、姆萨染色剂,Tris•HCI,SDS,EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K等【实验仪器】超净工作台，灭菌锅，显微镜，恒温培养箱，银子，解剖刀，剪子，接种针，铝饭盒,锡箔纸，记号笔，橡皮筋，试剂瓶，三角瓶移液管，培养皿，酒精灯等。【实验步骤】1、细胞凋亡的诱导过程：（1）抽取鸡血5ml,加入5ml0.85%的生理盐水,混匀后,在1200r/min的离心机中离心5mi