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1、角蛋白酶论文：枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因kerC在毕赤酵母中的表达研究【中文摘要】角蛋白酶(keratinase)是一种可特异降解角蛋白的蛋白酶类。近年来角蛋白酶在多个领域中具有良好的应用前景,特别是在饲料生产中,通过角蛋白酶作用将废弃羽毛降解后作为动物饲料的添加剂,充分利用废弃的羽毛蛋白资源,这将改善蛋白质饲料短缺的现状。本研究利用DNA重组技术将来自于枯草芽孢杆菌B-3的角蛋白酶基因kerC表达在巴斯德毕赤酵母X-33中,成功实现了角蛋白酶基因kerC在真核表达系统中的高效表达,并对其酶学性质进行了研究,主要研究结
2、果如下：1.根据枯草芽孢杆菌B-3角蛋白酶基因kerC(GenBankNo.:JN021789),设计去除信号肽并含有EcoRI和XbalI酶切位点的上下游引物,PCR扩增角蛋白酶基因kerC表达片段。测序表明,扩增kerC基因表达片段中3个碱基发生错义突变,致使3个氨基酸发生改变。对编码的角蛋白酶蛋白空间结构进行分析,发生改变的3个氨基酸部位未在其活性中心。2.将重组表达载体pPICZaA-kerC线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母X-33感受态细胞,转化子经Zeocin的抗性筛选、PCR鉴定和酶活力测定,确定6株阳性
3、转化子。重组菌株P.X.KC-9在以1%浓度的甲醇诱导培养108h后,其酶活力最高,达到32.31U/mL,比活力为95.43U/mg。3.测定该重组角蛋白酶的酶学性质,结果表明,重组角蛋白酶kerC的最适反应温度为60℃,在30℃-65℃范围内能保留最高酶活的97%以上。kerC的最适反应pH为pH7.5,在中性和弱碱性环境中对羽毛粉具有较强的降解能力,在pH7-8范围区间内能保持最高酶活的80%以上。在0.33mM的离子作用浓度环境中,Fe2+、Co2+和Ca2+能增强kerC角蛋白酶的活力,其中Fe2+提高36
4、.44%。Fe3+完全抑制重组角蛋白酶的酶活力,Na+、Mn2+、Zn2+、Mg2+和Cu2+也均15.56%-77.78%范围内,不同程度上抑制了重组角蛋白酶的酶活力。经SDS-PAGE分析,重组菌株P.X.KC-9表达的角蛋白酶的分子量约为31KDa,与预测值相近。【英文摘要】Keratinasesareagroupofproteolyticenzymesthatcanhydrolyzeinsolublekeratins.Inrecentyears,keratinaseshavebeenusedinthefiel
5、dsofleatherprocessing,detergentmanufactureandfeedproduction.Therefore,keratinaseshavedisplayedsatisfactoryapplicationperformanceandeconomicvalue.Particularlyinanimalfeedadditives,thebioconversionofchickenfeatherkeratinintoanimalfeedstuffswillamelioratetheshorta
6、geofproteinfeed.ThekeratinasegenekerCwithoutleadersequencefromBacillussubtilisB-3wasclonedintovectorpPICZaAforextracellularexpressioninPichiapastorisX-33.KerCwasexpressedsuccessfullyintheEukaryoticexpressionsystem,andtheexpressionconditionwashighlyimproved.1.Ac
7、cordingtothesequenceofkeratinasegenekerCfromBacillussubtilisB-3,apairofprimerscontainingtherestrictionsitesofEcoRIandXballwasdesignedandsynthesized.ThesequenceofkerCwithoutpeptidesequencewasamplifiedbyPCRandclonedintovectorpPICZaA,recombinantplasmidpPICZaA-kerC
8、wasconstructedsuccessfully.TheamplifiedsequenceofkerCgeneratedthreebasesmissensemutationthatresultedinthechangeofthreeaminoacids.Accordingtotheanalysisofspatialstructurefork
