羽毛降解菌枯草芽孢杆菌b3的分离鉴定及角蛋白酶基因的克隆表达

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1、论文独创性声明山研究生：和市乙本人郑震声明:所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注利致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一向工作的问志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。却（C1年Olfj）j3关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，ep:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复

2、印件和电子版，允许论文被青阅和借阅，可以采用影印、缩卬或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不问媒体上发表、传播学位论文的全部戚部分内容。研究生签名:腋日巳.1-0（0年06月）：LH师签名:名中文摘要角蛋白酶(kenuinase)是一种能特异降解角蛋白的蛋白酶。近年来随着角蛋白酶在去垢剂的制造、皮革加工、食品工业和饲料生产中广泛的应用阳口益受到人们的青睐。本文以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处采集的土壤为样品，筛选出…株可以利用羽毛并能高效降解羽毛粉的枯草芽抱杆菌，并克降了

3、其辰厂C基因和实现了该基因在大肠轩菌中融合表达。1.从四川农业大学养鸡场长期堆砌废弃羽毛处采集的土壤中筛边出了具有降解角蛋白能力的7株细菌。对其中产角蛋白酶酶活的最高的B-3菌株进行了形态观察、生理生化特性以及系统发育树分析，鉴定B-3为枯草芽他轩酶，该菌发酵产角蛋白酶酶活力可达2.26lU/mLo2・利用PCR技术克降了编码柏革穿伯杆菌B-3的角蛋白酶基因。该基因序列全长1146坤，编码381个氨基酸，含倍号肤序列。与GenBank数据库比对分析发现该基因与数据库中来自枯草芽跑杆菌YYW斗的辰厂C基因(

4、GenBankNo.:EU362730)相似性达到100%。蛋白结构域分析显示，kerC含两个丝氨酸蛋白酶家族的保守结构域，属于丝氨酸蛋白酶家族成员。3.以克降的枯草芽抱杆菌B-3角蛋白酶基因为基础，利用大肠杆菌表达载体pET-32a(+)构建kerC原核表达载体pET-kerC,并转化人肠轩菌BL21(DE3)诱导表达。结果表明，该酶在大肠轩菌中获得了高效表达，在重组菌细胞裂解上清液中检测到角蛋白酶活性，酶活力可达14.814U/mL，比活力可迦0852IU/mgoSDS.PAGE分析表明，重组角蛋白酶

5、分子最为60kDa左右(融合了硫氧还蛋白，Trx)o对重组角蛋白瞒自每学性质分析表明，该酶的最适反应温度为65.C,最适pH值为7.0,热稳定性较差，耐碱(pH5.5-10.0处理后残余酶活力可保持最商酶洒的80%以上)。关键词:角蛋白酶:枯草芽抱杆菌日-3;筛选:基因克降:原核表达AbstractKer^ijinolyticenzymes,calledkeratinases,areagroupofenzymeswhichareable(0hydrolyzeinsolublekeratins.Kerati

6、nasesareusuallyusedindegradationofkeratin-containingwastesforindustrialapplication,whichisimportantforpotentialapplicationsinu©阳treatment,animalfeedproductionandrecyclingoftheinsolubleproteins.r

7、lerefbre,keratinaseshadshownsatisfactoryapplicationperforman

8、ceandeconomicvalue.Afeather-degradingBac订伽subtiliswasisolatedfromthefeatherwastesiteofpoultry也rmofSichuanagriculturalwlLiersity>andthegenekerCvvcoclonedandexpressedinE.coliBL21(DE3)in由ispaper.1.Sevenfeather-degradingbacteriawereisolatedfromthefeatherwaste

9、siteofpoultryfannofSichuanagriculturaluniversity.B-3showedthestrongestfeather-degradingabili叩制nongtheisolatedbacteria、whichw&choosedforfutherstudy.Basedonmorphological,physiologicalandbiochemicalcharacteristics，ands