多糖分离纯化及含量测定1

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1、多糖的分离纯化与含量测定张黎明天津科技大学生物工程学院2013年4月29日生物制药技术专题主要讲授内容一、多糖的提取方法二、多糖的纯化方法三、多糖含量的测定方法四、纯度与相对分子质量的检测polysaccharide;separation；extraction;isolationpurification;contentdetermination;前言多糖在早期的天然产物化学研究中,因活性不明显,常作为无效成分弃去。由于化学、生物学、药理学等学科的飞速发展,自20世纪80年代来,人们对多糖的生物活性有了新的认识。药理实验研究显示,多糖具有许多生物活性功能,包括免

2、疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌、抗病毒、保护肝脏等,且对机体毒副作用小。因此,对多糖的研究开发已成为医药保健品行业热门领域。如香菇多糖、灵芝多糖、云芝多糖已在国内外临床上广泛应用。而其他一些多糖正在深入研究,如桑黄多糖、猪苓多糖、人参多糖、枸杞多糖等。生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖；植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提

3、取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理。一、多糖的提取方法1.溶剂提取法水提醇沉法、酸提法、碱提法、超临界流体萃取法2.酶解提取法单一酶解法、复合酶解法3.强化提取法超声波辅助提取法、微波辅助提取法、高压脉冲法1.溶剂法：水提醇沉法多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗漉，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置一定的时间，多糖的质量分数和得率

4、均较高。影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。该种方法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。溶剂法：酸提法为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH值下难以溶解；含有胺基的多糖可使用乙酸或盐酸调节提取液成酸性进行提取，然后再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合

5、物或盐类沉淀而析出。影响多糖提取率的因素有：水的用量、pH值、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高；但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。溶剂法：碱提法有的酸性多糖,或分子量较大的多糖,在热水中溶解度不大,一般在稀碱溶液中溶解度较大,所以常用稀的NaOH溶液或Na2CO3溶液提取。不过用稀碱溶液提取时,提取温度必须保持在10℃以下,否则多糖容易发生降解反应。多糖在碱性溶液中稳定，例如粘多糖的提取

6、多采用碱提取法。多糖碱法提取虽然可提高多糖的收率,且可缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质如蛋白质,粘度过大,过滤困难,且有些多糖在碱性较强时会水解。通常先用热水法提取,然后残渣再用稀碱溶液提取,这样可将大部分多种类型的多糖提取出来。溶剂法：超临界流体萃取法超临界流体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，即密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。超临界流体萃取技术是近年来

7、发展起来的一种新的提取分离技术。由于CO2的超临界条件（TC＝31.26℃，Tp＝7.38MPa）容易达到，常作为超临界萃取的溶剂，在压力为8～40MPa时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入夹带剂后则可溶解极性化物。由于糖类的化合物分子量较大、羟基多、极性大，用纯二氧化碳提取产率较低，加入夹带剂或加大压力则可提高提取率。该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。2.酶解法：单一酶解法单一酶解法是指使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术。其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变

8、得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中