chapter9.转基因动物

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1、第九章转基因动物技术及其应用一、转基因动物概述转基因动物(TransgenicAnimal)是指通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物基因或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白基因等（通称为外源基因）导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。（曾溢滔院士）转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因组内稳定整合并能稳定表达和遗传的一类动物（包括基因敲除的动物）。遗传性动物基因工程：外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定遗传。非遗传性动物基因

2、工程：转基因仅在当代表现，不能遗传给子代。一、转基因动物概述1）第一例显微注射法产生转基因小鼠1980年，Gordon等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。3）转基因家畜的产生转基因家兔、绵羊和猪(Hammer等，1985)、牛(Bondioli等，1988)和山羊(Ebert等，1991)等相继出世。一、转基因动物概述2）“硕鼠”1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了“硕鼠”，首先证明外源基因可在受体中表达，并且表达产物具有生物活性。

3、4)利用转基因生产重组蛋白1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的β-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了α-抗胰蛋白酶。目前，已有多种蛋白实现了转基因生产。一、转基因动物概述目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等5个方面。转基因动物实例超级奶牛－普通奶牛的三倍大（英国）国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪（东北农业大学）正在进行转基因山羊的实验乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊上海交通大学医学遗传研究所转基因动物实例人兽杂交英国《每日邮报》20

4、12年7月23日报道，英国多家实验室在过去3年中一直秘密进行人兽杂交胚胎的实验，并且已经制造了150多个同时包含人类和动物基因的杂交胚胎。这些实验都是在《人类受精与胚胎学法案》颁布之后实施的，目的据称是为了通过胚胎干细胞的研究为多种疾病寻找有效的疗法。《人兽杂交》，2010justajoke获取外源目的基因重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物二、转基因动物操作技术流程转基因动物的载体系统病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体反转录病毒载体腺相关病毒载体单纯疱疹病毒载体慢病毒载体表达型

5、质粒载体定向打靶载体随机基因敲除载体二、转基因动物操作技术流程病毒载体的不足：诱导机体的免疫反应，存在致毒、致癌的危险、载体容量有限、制备滴度不高等非病毒载体的优势：1.对DNA大小的限制较少，长达48kb的片段已被成功转移至细胞。2.没有对包装和复制所必需的病毒序列的要求，DNA易操纵3.DNA复合物不大可能有感染能力，比较安全。4.关于免疫原性，存在问题较少。要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒2、介导外源基因转移和表达3、对机体不致病1、动物基因工程载体之病毒载体优点：1、利用感染性进入细胞，转导效率高；2、复杂的装配过程由细胞

6、完成；3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。二、转基因动物操作技术流程1)逆转录病毒载体1、动物基因工程载体之病毒载体二、转基因动物操作技术流程逆转录病毒的生物学特性逆转录病毒是单链RNA病毒，侵染细胞后表达出自身的反转录酶，以单链的RNA基因组为模板，立即在寄主细胞中反转录成线性双链DNA，然后在整合酶（Int）介导下，整合到宿主基因组中（此时整合的病毒序列被称为前病毒），并在每次细胞分裂时，随宿主DNA一起复制。逆转录病毒的生活周期进入宿主细胞单链RNA逆转录酶双链DNA整合到宿主细胞基因组中（前病毒）宿主细胞RNA聚合酶RNA病毒RNA基

7、因组作为合成相应病毒蛋白质的模板（mRNA）包装成新的病毒颗粒，离开宿主通常不致死宿主细胞LTRgagpolenvφLTR长末端重复序列调节和启动转录产生病毒核心蛋白产生逆转录酶产生病毒外膜蛋白包装信号逆转录病毒的结构特征逆转录病毒载体的构建常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)构建的各类逆转录病毒载体LTRgagpolenvφLTR目的基因标记基因LTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白包装细胞系LTRLTR靶细胞目的基因标记基因LTRφLTR目的基因标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞，在靶细胞中整合至细胞

8、基因组稳定表达逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核酸部分只能是逆转录病毒载体)辅病毒φ重组病毒DNA转染进包装细胞系中，包装细胞系产生将病毒RNA包装成感