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时间:2018-07-22
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1、三种山羊全血基因组DNA提取方法的比较DNA提取是分子生物学研究中的一个关键环节,全血是常用于DNA提取的实验材料,有酚/氯仿提取法、碘化钠法及尿素提取等作为DNA提取的方法,但都存在不足之处。碘化钾法提取DNA1)取ACD抗凝血样300uL,加入到1.5mLEp—pendorf管中,再加入1000uL的0.9%NaCl溶液,旋涡振荡30s,12000r/min离心5min,弃上清。2)沉淀中加入血样300uL,然后加入900uL的0.9%NaCI溶液,旋涡振荡30S,12000r/min离心,5min,弃上清。3)沉淀中加入100uL的5mol/L碘化钾溶液,漩涡振荡30
2、s。加入300uL0.9%NaCI溶液和400uL的氯仿/异醇(24:1),旋涡振荡30s,12000r/min离心5min。取上清至新1.5mLEppendor管。4)加入异丙醇120uL轻轻混匀,12000r/min离心5min,弃上清;再加入提前冷却的无水乙醇1000uL,12000r/min离心5min,弃上清。5)沉淀用-20℃预冷1000ul的70%乙醇洗涤,12000r/min离心1min,弃上清;将离心管倒立于滤纸上风干;加80ul。TE溶解后,在4℃条件下过夜,使DNA水合,-20℃保存备用。酚/氯仿法1)取ACD抗凝血样400uL于1.5mLEppen—
3、dorf管中,再加入100uL红细胞裂解液(10mmol/LNaCl,10mmol/LTris-HCI,5mmol/LMgCl2),旋涡振荡30s,室温放置10min,12000r/min离心30s,弃上清。2)加120uL红细胞裂解液,旋涡振荡30s,室温放置5min,10000r/min离心30s,弃上清。3)沉淀中加30uL红细胞裂解液,旋涡振荡30s,加白细胞裂解液(5mmol/LNaCI,lOmmol/LEDTA,10mmol/LTris—HCl)300uL,10%十二烷基硫酸钠(SDS)8uL,蛋白酶K20uL(20mg/mL),56"C水浴消化3h,得到清亮粘
4、稠液体。4)加400uL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀,室温放置10min,12000r/min离心15min。取上清至新1.5mLEppendorf管。5)加等体积氯仿混匀,室温放置10min,12000r/min离心15min。取上清至新1.5mLEppendorf管。6)加1/lO体积3mol/L醋酸钠(pH5.2),2倍体积预冷无水乙醇,混匀,冰浴2~3min,12000r/min离心5min,弃上清。7)沉淀用20℃预冷1000uL的70%乙醇洗涤,12000r/min离心1min,弃上清;将离心管倒立于滤纸上风干;加50uLTE溶解,在4℃条件下过夜,使
5、DNA水合,一20℃保存备用。DNA浓度、纯度和完整性检测用NanoDropND-1000微型分光光度计(NanoDrop,USA)检测DNA产量和纯度,结果用平均数士标准误表示。用0.7%琼脂糖凝胶电泳检验基因组DNA的完整性。PCR扩增及检测为检查碘化钾法提取的基因组DNA质量,进行PCR扩增试验,扩增位点山羊生长激素基因部分序列。引物序列为,F:5‘GGAC-CCAGTTCACCAGACG-3’,R:5’-TCGCAT-TCAGAAGCCCTA-3’,由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR反应总体积为25.0uL,包括10umol/L的上、下游引物混合液1.0uL,
6、HotstartTaqMasterMix(TIANGEN)10uL,DNA模板1.0uL,去离子水13uL。反应程序为:预变性95℃5min;95℃30s,55℃30s,72℃30s,33个循环;最后72℃继续延伸8min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。碘化钾法可望成为提取山羊全血基因组DNA的理想方法。
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