动物细胞高纯内质网分离试剂盒产品说明书（中文版）

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1、动物细胞高纯内质网分离试剂盒产品说明书（中文版）主要用途动物细胞高纯内质网分离试剂是一种旨在通过机械或化学处理、差速和等密度离心方法，从动物细胞中分离出活性完整而高度纯化的内质网细胞器组分的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。适合于各种动物原代和培养细胞（人体、老鼠、兔子等）内质网的制备。可以被用于细胞色素P450系统外源化合物（xenobiotics）代谢、脂类代谢、内质网膜蛋白和腔内蛋白等研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用

2、，性能稳定，分离产量高。技术背景内质网（endoplasmicreticulum；ER）是真核生物的细胞器组分，构成细胞内小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互连接的网络结构，负责蛋白转译、折叠和转运成为细胞膜成分（例如跨膜受体和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），负责钙离子区隔（sequestration），以及糖原、固醇类和其它大分子的生产和储存等功能。内质网分成三种：粗面内质网（Roughendoplasmicreticulum；

3、RER）、滑面内质网（Smoothendoplasmicreticulum；SER）和肌质网（sarcoplasmicreticulum；SR）。根据细胞代谢的需要，粗面内质网和滑面内质网会互相转换。粗面内质网通过核糖体合成蛋白质并分类；滑面内质网进行固醇、碳水化合物和药物代谢等。肌质网的主要功能为储存和释放钙离子。内质网的分离是现代细胞生物学研究的常用手段之一：第一，通过机械或化学方法破裂组织细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得内质网；甚至，第四，可以

4、通过等密度离心获得纯度更高的内质网。产品内容清理液（ReagentA）毫升裂解液（ReagentB）毫升净化液（ReagentC）毫升活性液（ReagentD）微升强化液（ReagentE）毫升保存液（ReagentF）毫升高纯液（ReagentG）毫升分层液（ReagentH）毫升产品说明书1份保存方式保存净化液（ReagentC）和活性液（ReagentD）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备5HANK平衡盐缓冲溶液（HL12028）或PBS缓冲溶液（HL12033）

5、：用于清理细胞胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（HL12052）：用于细胞处理所需的培养基50毫升锥形离心管：用于样品制备的容器15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器1.5毫升离心管：用于样品操作的容器6毫升超速离心管：用于超高速离心的容器4℃台式离心机：用于样品制备4℃超速离心机：用于样品制备DOUNCE匀浆器：用于裂解组织试管固定支架：用于离心管固定支撑3号针筒和18号针头：用于收集样品实验步骤一、组织匀浆法实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent

6、C）和活性液（ReagentD）冻融，然后移出移取xx微升活性液（ReagentD）、xx毫升净化液（ReagentC）到xx毫升的裂解液（ReagentB）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。1．准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5X107），直至细胞生长铺满整个培养表面2．分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去3．重复实验步骤2一次4．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞

7、生长表面5．置入37℃培养箱3分种6．轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，7．分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液8．移入一个50毫升锥形离心管9．放进台式离心机离心10分钟，速度为200g10．小心抽去上清液11．加入xx毫升预冷的清理液（ReagentA），混匀细胞12．放进台式离心机离心10分钟，速度为300g13．小心抽去上清液14．加入xx毫升预冷的裂解工作液15．涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群16．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器17．在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约20至40下）（注意

8、：参见注意事项7）18．将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管19．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g20．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——21．放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为12000g51．小心移出上清液到预冷的6毫升超速离心管——2．放进4℃超速离心机再次离心60分钟，速度为100000g3．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒――4．即刻加入xx微升保存液（ReagentF），充分混匀沉淀物5．置于冰槽里备用6．准备1个6毫升超速离心管7