重组羧肽酶原b甲醇酵母构建及分泌表达

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1、重组羧肽酶原B甲醇酵母构建及分泌表达摘要：目的构建重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株。方法将羧肽酶原B编码基因整合入酵母质粒，电转化至甲醇酵母中，His缺陷培养基和G418抗性筛选获得阳性克隆株。用大肠杆菌表达的羧肽酶原B免疫家兔制备羧肽酶原B兔抗血清；经发酵、甲醇诱导后，蛋白质印迹（Western-blotting）免疫检测蛋白质的表达。结果获得高抗体滴度的羧肽酶原B兔抗血清，蛋白质印迹免疫检测重组酵母经甲醇诱导表达后的上清阳性。结论获得了重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株，可分泌表达重组羧肽酶原B。关键词：羧肽

2、酶原B；甲醇酵母；表达；多克隆抗体制备；蛋白质印迹中图分类号：Q556文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)11-0005-03ConstructionandSecretedExpressionofRecombinantProcarboxypeptidaseBinPichiapastorisLISu-xia,YUANQin-sheng(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechno

3、logy,Shanghai200237,China)9Abstract：ObjectiveToconstructtherecombinantprocarboxypeptidaseBinPichiapastoris.MethodsTheyeastplasmidcontainingprocarboxypeptidaseBcodinggenewasconstructed,andthentransferredtoPichiapastoris.ThepositiveclonewasobtainedbyG418resi

4、stanceselectioninHis-medium.Therabbitanti-ratrecombinantprocarboxypeptidaseBserumwaspreparedwithrecombinantprocarboxypeptidaseBexpressedinE.coli.Western-blottinganalysiswasusedtodeterminetheexpressedproteinwiththepreparedantiserumafterfermentationandmethan

5、olinductionofrecombinantyeast.ResultsTherabbitanti-ratrecombinantprocarboxypeptidaseBserumwithhigherantibodytiterwasgot.TheresultofWestern-blottinganalysisshowedthatthesupernatantwaspositivewiththeantiserumaftermethanolinductionofrecombinantyeast.Conclusio

6、nTherecombinantprocarboxypeptidaseBinPichiapastoriscanbeconstructedwiththesuccessfulsecretionofrecombinantprocarboxypeptidaseB.9Keywords：procarboxypeptidaseB;Pichiapastoris;expression;polyclonalantibodypreparation;Western-blotting羧肽酶B（carboxypeptidaseB，CPB

7、，EC3.4.17.2）是一种含锌的胰外肽酶，特异性水解肽链C端的碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸，CPB含307个氨基酸，Mr约35×103。天然CPB由前羧肽酶原B（preprocarboxypeptidaseB）产生，其N端包含108个氨基酸（其中13个氨基酸为信号肽序列，95个氨基酸组成活性肽部分）片段，并与C端的CPB相连，前羧肽酶原B在转运到内质网的过程中，信号肽被切掉，得不具有酶活性的羧肽酶原B（procarboxypeptiedaseB，pCPB）从细胞中分泌，然后通过胰蛋白酶将其酶解为具

8、有酶活性的CPB和活性肽部分[1]。目前，商业及研究所用的CPB均从动物胰腺提取，价格昂贵，且不能完全去除其他蛋白酶。重组CPB与生物提取的CPB相比，具有无动物源性、无其他蛋白酶混杂等特点。pCPB可在大肠杆菌中表达，但是以包涵体形式存在，需经过超声波破碎细胞及包涵体复性等过程[2]。所以，我们尝试用甲醇酵母（Pichia9pastoris）表达pCPB。甲醇酵母具有高等真核表达系统的许多优点，如蛋白质加工，蛋