羧肽酶a1全酶及其肽段基因的克隆及分泌表达论文

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1、羧肽酶A1全酶及其肽段基因的克隆及分泌表达论文【摘要】目的：克隆人羧肽酶A1（CPA1）全酶及其4条肽段基因，构建重组表达载体，并在COS7细胞中分泌表达.方法：以胰腺总RNA为模板，RTPCR扩增CPA1全酶基因；再以全酶基因为模板，PCR扩增其4条肽段基因；扩增产物分别克隆于分泌表达载体pFLAGCMV1中构建重组载体；然后用脂质体转染COS7细胞，分泌表达融合FLAGtag的目的蛋白和肽段；点印迹法检测目的蛋白的表达.结果：获得了CPA1全酶及其4条肽段基因，构建了重组表达载体，测序证实插入

2、序列正确.freeleprodrugtherapy，ADEPT)中用于治疗结肠癌的羧肽酶G2系统已进入临床实验［1-2］.目前，构建抗体酶融合蛋白及其应用已经成为研究热点［3］.有研究［4-5］发现人羧肽酶A1（carboxypeptidaseA1，CPA1）其分子量大，在临床试验研究操作中存在一定困难.已克隆并表达的CPA1活性中心仅有全酶的一半分子量，虽然此活性中心分子量较小，但存在活性较低的问题.我们通过在活性中心两侧扩展片段的方法来提高酶活性，克隆并分泌表达了CPA1全酶及其包括活性中心在内的的4条

3、肽段，为下一步酶活性测定并筛选出活性高而分子量低的酶片段奠定基础.1材料和方法1.1材料COS7细胞，E.coliDH5α为西京医院检验科临床分子生物学实验室保存；真核细胞分泌表达载体pFLAGCMV1由第四军医大学遗传与发育生物学教研室韩骅教授惠赠；逆转录试剂盒(Primescript1stStrandcDNASynthesisKit)，TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，HindⅢ/BamHⅠ限制性内切酶，DNAMarker（大连Takara公司）；小量质粒提取和胶回收试剂盒（上海EM干粉培养基（

4、美国Gibco公司）；化学发光底物试剂盒（美国Pierce公司）.其余均为国产分析纯试剂.1.2方法1.2.1引物设计根据已报道的CPA1cDNA（GenBankAccessionNo.NM001868）序列设计3条正义链引物和2条反义链引物.正义链引物：P1：5′GCGAAGCTTAAGGAGGACTTTGTGG3′；P3：5′CGAAAGCTTATCGACACGGGCATCCAT3′；P5：5′TTTAAGCTTCCGCACCTTGTCAGCAAG3′；反义链引物：P2：5′GTTGGAT

5、CCTCAGTAGGGGTGATTCAG3′；P4：5′TTTGGATCCTTAGTCCCGGAGCTCGAA3′.引物由大连Takara生物工程公司合成，其中正义链引物5′端引入HindⅢ酶切位点，反义链引物5′端引入BamHⅠ酶切位点和终止密码.P1/P2扩增序列为全酶基因，长1209bp，记为cpa1，翻译后产物记为CPA1；P3/P4扩增序列为活性中心基因，长630bp，记为a，翻译后产物记为肽段A；P5/P4扩增序列为活性中心基因与其上游102bp碱基，长732bp,记为b，翻译后产物记为肽段

6、B；P3/P2扩增序列为活性中心基因与其下游108bp碱基，长738bp，记为c，翻译后产物记为肽段C；P5/P2扩增序列为活性中心基因与其上游102bp碱基及下游108bp碱基，长840bp，记为d，翻译后产物记为肽段D.1.2.2PCR扩增基因取实验室冻存正常胰腺组织总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录，得到胰腺组织cDNA；以逆转录产物为模板，P1/P2引物PCR扩增CPA1全酶基因；再以全酶基因为模板，相应引物PCR扩增CPA1的4条肽段基因.PCR反应体系与TaqDNA聚合酶说明书50μL体系相

7、同，反应条件：95℃5min后，95℃变性1min，57℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，经过30个循环，最后72℃延伸5min.PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果.1.2.3构建重组表达载体用HindⅢ和BamHⅠ双酶切纯化的PCR产物和表达载体pFLAGCMV1，30℃，2h；酶切产物经电泳、胶回收后用T4DNA连接酶4℃过夜连接，得到的重组表达载体转化DH5α感受态细胞，用含0.1g/L氨苄青霉素的LB平板进行筛选.1.2.4双酶切鉴定重组质粒抗性筛选得到的阳性克隆增菌后提取质粒

8、，HindⅢ和BamHⅠ双酶切重组质粒，酶切产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果.1.2.5重组质粒序列测定质粒双酶切阳性的克隆菌送北京奥科生物工程公司进行序列测定.经序列分析后，所得正确重组表达质粒分别命名为pFLAGCMV1cpa1，pFLAGCMV1a，pFLAGCMV1b，pFLAGCMV1c和pFLAGCMV1d.1.2.6转染COS7细胞用去内毒素质粒中提试剂盒制