第七章外源基因的表达及其优化策略

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1、第七章外源基因的表达及其优化策略第一节　影响外源基因表达的因素第二节　外源基因在原核细胞中的表达第三节　外源基因在真核细胞中的表达第一节　影响外源基因表达的因素基因表达：从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息,通过密码子和反密码子系统,转变由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可

2、高产的表达产物。第一节　影响外源基因表达的因素第一节　影响外源基因表达的因素基因表达遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。第一节　影响外源基因表达的因素克隆基因的表达外源基因在宿主细胞中表达外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞第一节　影响外源基因表达的因素影响外源基因表达的因素主要有：阅读框架顺式作用元件翻译过程表达体系第一节　影响外源基因表达的因素一、阅读框架对转化基因的影响什么是阅读框架(openrea

3、dingframe,ORF)?二、顺式作用元件对基因表达的影响1.对基因转录起始的调控1)启动子2)增强子3)沉默子第一节　影响外源基因表达的因素二、顺式作用元件对基因表达的影响2.对基因转录终止的调控1)终止子2)衰减子3.对DNA结构的影响1)核基质结合区：一段与核基质特异结合的DNA序列。2)绝缘子：对一侧有作用，对另一侧没有。3)基因座控制区：通过改变染色质结构导致基因转录。第一节　影响外源基因表达的因素三、翻译过程对表达的影响1.翻译起始对基因表达的影响2.密码子偏爱性对基因表达的影响3.翻译

4、终止对基因表达的影响四、表达系统对表达产物的影响第二节外源基因在原核细胞中的表达外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。宿主细胞分为两大类：第一类为原核细胞：大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。第二节外源基因在原核细胞中的表达用原核生物作宿主。AdividingE.coli原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子第二节外源

5、基因在原核细胞中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物第二节外源基因在原核细胞中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白真核与原核生物结构上存在差别第二节外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物细胞表达的

6、特点1.原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。2.原核生物的表达是以操纵子为单位的。Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。第二节外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物细胞表达的特点3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。第二节外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物细胞表达的特点6.在大肠杆菌mRNA的核糖体结

7、合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16SRNA3’末端碱基互补的序列，即SD序列。Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。第二节外源基因在原核细胞中的表达二、外源基因在原核细胞中表达具备条件1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。3.必须利用原核

8、细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(ORF)。5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。第二节外源基因在原核细胞中的表达原核生物基因表达载体的组成特征启动子核糖体结合位点(SD序列)终止子选择标记基因复制子原核生物基因表达的受体系统大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统链霉菌受体系统、蓝藻受体系统大肠杆菌表达载体的基本成分第二节