定向酶法制备活性肽分析系统的研究

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1、目录目录摘要IAbstractII第一章绪论11.1酶法制备活性肽研究现状11.2ACE抑制肽21.3ACE抑制肽的蛋白源21.4课题立题意义和主要内容3参考文献4第二章数据库的建立以及分析系统软件的编写82.1前言82.2系统设计82.2.1设计思想82.2.2硬件与软件配置82.2.3资料的收集与整理92.2.4系统的结构与功能92.3数据库系统的维护及扩充102.4软件功能使用实例102.5本章小结15参考文献16第三章分析系统在实验中的应用203.1前言203.2材料与方法203.2.1实验材料和主要试剂203.2.2主要仪器203.2.3实验方法

2、213.2.3.1计算机分析：蛋白质筛选、蛋白质水解酶的筛选使用见2.4213.2.3.2水分含量测定：105℃恒重法GB5497-85213.2.3.3粗蛋白含量测定：微量凯氏定氮法GB5511-85213.2.3.4粗脂肪含量测定：索氏抽提法GB5512-85213.2.3.5灰分含量测定：550℃灼烧法GB5505-85213.2.3.6蛋白质水解物制备的的步骤213.2.3.7正交实验酶解优化条件213.2.3.8水解物冷冻干燥213.2.3.9水解度的测定213.2.3.10酶解产物的ACE抑制活性的体外检测233.3实验结果与讨论233.3.1

3、ACE抑制肽底物蛋白的计算机筛选结果233.3.2原料成分分析253.3.3胰蛋白质水解酶水解小麦谷朊粉的结果分析253.3.4碱性蛋白质水解酶水解小麦谷朊粉的结果分析263.3.5水解物ACE抑制活性检测273.4本章小结28参考文献29第四章ACE抑制肽的纯化与结构鉴定304.1前言304.2材料与方法304.2.1实验材料与主要试剂304.2.2主要仪器304.2.3实验方法314.2.3.1SephadexG-15分离纯化ACE抑制肽314.2.3.2RP-HPLC分离纯化ACE抑制肽31I目录4.2.3.3LC/MS鉴定ACE抑制肽氨基酸序列31

4、4.2.3.4ACE抑制活性的测定314.3结果与讨论314.3.1SephadexG-15分离ACE抑制肽314.3.1.1不同样品浓度对SephadexG-15分离ACE抑制肽效果的影响324.3.1.2洗脱液不同流速对SephadexG-15分离ACE抑制肽效果的影响324.3.1.3SephadexG-15分离蛋白质水解物所得不同组分的ACE抑制活性344.3.2半制备HPLC分离纯化ACE抑制肽344.3.3ACE抑制肽的氨基酸组成354.4本章小结38参考文献39结论40致谢41攻读硕士期间申请专利及发表的论文清单42论文创新点43I摘要摘要本

5、课题首先利用AccessXP数据库软件建立了蛋白质数据库、活性肽数据库、蛋白质水解酶数据库，利用VB编写“定向酶解制备活性肽分析系统”程序。蛋白质数据库中包含常见的食物蛋白质的一级序列、链长、分子量等信息；活性肽数据库包含活性肽的功能、氨基酸序列、PI参考文献等信息；蛋白质水解酶数据库包含蛋白质水解酶的酶切位点、参考文献等信息。数据库与“定向酶法制备活性肽分析系统”程序配合，实现活性肽在蛋白质中搜寻并给出活性肽在蛋白质中的含量，实现蛋白质用单酶或者复酶的模拟水解等功能。本课题在利用“定向酶解制备活性肽分析系统”分析常见食物蛋白中ACE抑制肽含量的基础上，选

6、定小麦蛋白质作为ACE抑制肽的蛋白源。通过分析活性肽数据库中ACE抑制肽的结构特点并结合蛋白质水解酶的作用位点，模拟水解小麦蛋白质。模拟水解结果显示，碱性蛋白质水解酶更适合制备ACE抑制肽，实验同时选用胰蛋白质水解酶作为比较。通过分析数据库以及正交试验筛选出碱性蛋白质水解酶作为小麦蛋白质的水解酶，并确定优化条件：酶用量22.5μL/g，pH值9.5，温度60℃。实验以样品浓度：200mg/ml；上样量：2ml；流速：0.25ml/min；洗脱剂：0.01mol/LHAc-NaAc缓冲液（pH4.0）通过SephadexG-15分离所得的最高活性组分经半制备

7、RP-HPLC分离后得到了高纯度的单一活性组分。经氨基酸组成分析和LC/MS鉴定，从小麦蛋白质Alcalase水解物中分别鉴定出一种新的ACE抑制肽PLY，其IC50值为15.3μM，小麦蛋白中有354条一级序列包含PLY片断，PLY符合ACE抑制肽的规律。论文通过实验初步验证了“定向酶法制备活性肽分析系统”可行性。关键词：数据库，生物活性肽，蛋白质序列，活性肽序列，蛋白质水解酶，血管紧张素转化酶抑制肽，Alcalase蛋白质水解酶I摘要AbstractFirstly,thepapermakesuseofMSAccesstosetupproteindata

8、base,activepeptidesdatabaseandpro