酶法水解牡蛎制备血管紧张素转换酶抑制肽的研究

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1、河北农业大学硕士学位论文酶法水解牡蛎制备血管紧张素转换酶抑制肽的研究姓名：苑园园申请学位级别：硕士专业：农产品加工及贮藏工程指导教师：檀建新；张伟20120520摘要本试验以牡蛎为原料，选用适合的蛋白酶对其进行水解，水解液经过初步分离纯化后，得到血管紧张素转换酶抑制肽(ACEIP)。本论文主要包括以下几个方面的工作。1．建立高效液相色谱法(HPLC)快速检测血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性的方法。HPLC检测条件为：以ODSC18柱(5btm，1501TIITI×4．6mm)为色谱柱，乙睛一水(20：80，VⅣ，含0．59／oo甲酸)为流动相，流速1mL／min，检测波长为228nl"n。结

2、果表明：马尿酸在0．1I-tg／mL～500}tg／mL质量浓度范围内线性关系良好，相关系数r=0．9999；平均回收率为89．77％～99．57％，RSD为O．01％～1．52％。不同的ACE抑制剂检测结果证明该方法操作简便快速、重现性好、准确度高，可以作为ACE抑制剂体外活性的检测方法。2．采用检测ACE酶活性的HPLC法，对自制猪肺ACE酶催化反应条件进行了优化，结果表明ACE与底物HGG的最佳反应条件为：底物HGG和ACE的最适反应浓度分别为5mmol／L和12．5mg／mL，反应时间30min。以水解度(DH)为指标，测定了时间因素对不同蛋白酶酶解牡蛎蛋白的影响，表明4h时水解基本完

3、全，中性蛋白酶水解度最高，达到89．88％，木瓜蛋白酶水解度最低，为34．51％。探讨了牡蛎蛋白的水解度与ACE抑制活性的关系，证明水解15min后，酶解产物ACE抑制率可达较高水平，随时间延长而缓慢增加或减少；其中胃蛋白酶水解牡蛎蛋白的酶解物对ACE的抑制率最高，1200U／g底物的添加量、水解4h的条件下，其抑制率可达96．99％，且酶解物可保持至少12h内稳定存在不被水解。3．胃蛋白酶水解产物经G75凝胶色谱分离可得A、B两个蛋白峰，SDS—PAGE分析表明具ACE抑制活性的B峰分子量在6kDa以下，用G25凝胶层析分离B峰得到一个c峰，尝试用反相高效液相色潜法(RP．HPLC)进一步分

4、离纯化，在优化的色谱条件下(色谱柱：ODSC18柱(5I．tm，150mm×4．6mm)，流动相：乙睛一水(15：85，V／V，含O．5％o磷酸)，流速O．8mL／min，检测波长：265nm)分离得到三个峰，用MALDI．TOF．MS测定了三个峰的分子量，其主要组分的分子量分别为973．583Da、1086．715Da、1353．821Da：DSC熔点测定结果也表明，各峰组成并非单一组分，可能由一种短肽为主的多种短肽构成，故有待进一步纯化。关键词：长牡蛎；血管紧张素转换酶；酶解；ACE抑制肽；分离纯化ResearchonPreparationofAngitensinCovertingEnzy

5、meInhibitoryPeptidesfromOysterProteinbyEnzymaticHydrolysisAuthor．YuanYuan-yuanSupervisor：Prof．TanJian-xin，Prof．ZhangWeiMajor．AgriculturalProductsProcessingandStorageEngineeringAbstractTheOyster(Crassostreagigas)meetwasdegistedbydifferentproteasesandtheangiotensincovertingenzymeinhibitorypeptideswere

6、separatedandpartiallypurifiedfromoysterinthisstudy．Thewholeworkincludedthreepartsdescribedbelow．1．ArapidHPLCmethodWasdevelopedforthedeterminationofAngiotensinI—ConvertingEnzyme(ACE)inhibitoryactivity．The11ippuricacidformedfromtheACEcatalyzedhydrolysisofHGGwasseparatedandidentifiedbyHPLCmethod(ODSC18

7、column(5lxrn，150InlTl×4．6mm)，elutingsolution：acetonitrileandwater(20：80，V代contMningO．5‰methanoicacid)，flowrate：1mL／min，detectionat228nm)．Thedevelopedcalibrationcurveofhippuricaciddisplayedgoodlinearit