凝血酶敏感蛋白-1对胆囊癌细胞凋亡实验探究

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1、凝血酶敏感蛋白-1对胆囊癌细胞凋亡实验探究【摘要】目的研究凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)对胆囊癌细胞GBC-SD凋亡的体外诱导作用及其可能的作用机制。方法采用流式细胞术检测TSP-1及其受体CD36，CD47作用后HCCLM3的凋亡率，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Caspase-3mRNA表达的变化。结果TSP-1组凋亡率(10．56±0．63)%显著高于对照组(3．17±0．33)%和CD47阻断组(4．05±0．27)%(P0．05)。CD36阻断组(8．49±0．37)%与对照组和TSP-1组比较均差异有统计学意义(P<0．01)，对TSP-1的阻断作用低于CD47抗

2、体阻断组。TSP-1组凋亡率显著高于对照组和CD47阻断组，(P<0．01)。2．2TSP－1对HCCLM3细胞Caspase3表达的作用Caspase3mRNAPCR扩增产物凝胶电泳图谱在212bp和647bp位置分别可见GAPDH和Caspase3mRNA清晰条带。TSP-1组(0．575±0．026)和CD36阻断组(0．583±0．023)中Caspase3mRNA的表达显著高于对照组(0．336±0．031)和CD47阻断组(0．412±0．017)(P<0．01)。TSP-1组和CD47阻断组之间、对照组和CD36阻断组之间相比无显著性差异。3讨论5胆囊癌恶性程度高，一经确

3、诊大多已属晚期，手术切除率低，对放疗或著化疗敏感性差。有研究显示凋亡与胆囊癌的发生、发展过程密切相关[3]，所以研究诱导胆囊癌细胞凋亡的调控因素及其作用途径显得十分必要，并且对于阐明胆囊癌的发生、进展机制，进而寻找可能的靶向治疗的分子标志具有一定的意义。在众多的相互作用的细胞因子网络中，TSP-1是被较早发现的一种多功能糖蛋白[4]，可通过分子内部各功能区与细胞外基质、粘附分子、及其受体等相互作用从而诱导其他肿瘤细胞凋亡。TSP-1与胆囊癌细胞的凋亡有无关系尚未见报道。本实验通过体外研究显示：TSP-1作用于胆囊癌细胞株GBC-SD72h后细胞凋亡显著增加。而经过特异性单抗受体CD47

4、与TSP-1的结合后，凋亡率与TSP-1组比较显著降低，而与对照组相比无差异，阻断了TSP-1诱导HCCLM3细胞调亡的作用；阻断TSP-1与受体CD36的结合后凋亡率与对照组和TSP-1组比较均有显著性差异，但对于TSP-1的阻断作用远低于CD47抗体阻断组。提示TSP-1诱导胆囊癌细胞凋亡的作用主要是通过与CD47的结合激活下游分子而发挥作用的。5Caspase-3是直接诱导各种肿瘤细胞凋亡的关键因子，有研究显示随Caspase-3的异常表达与胆囊癌的病理特征和预后密切相关，体外实验也证实Caspase-3在胆囊癌细胞的凋亡过程中也发挥了重要作用[3]。本研究发现TSP-1作用于G

5、BC-SD后Caspase3表达量与对照组相比显著增加，而CD47阻断组与TSP-1组相比Caspase3表达量显著下降，而CD36阻断组与TSP-1组相比差异不显著，说明TSP-1诱导HCCLM3凋亡的作用途径之一是通过与受体CD47结合后上调Caspase3的表达来实现。有报道CD47可与TSP-1的羧基端细胞结合域(CBD)结合,调节整合素活性[5]。Caspase-3导致细胞凋亡的机制有可能是酶切凋亡抑制蛋白bcl-2使其失去抑制细胞凋亡的生物活性[6]；还可直接裂解细胞组分或裂解细胞骨架调节蛋白导致细胞裂解凋亡[7]。以上结果说明TSP-1在胆囊癌凋亡的调控网络中具有一定作用

6、，而通过与受体CD47的结合可能是其发挥作用的主要途径。CD36也可部分介导TSP-1诱导凋亡，但作用较弱。TSP-1的作用具有多样性，完全阐明其作用和作用机制尚需更进一步的深入研究。参考文献［1］黄志强．胆道肿瘤．见:吴阶平，裘法祖.黄家驷外科学，人民卫生出版社,2000:1290-1293.［2］EsemuedeN,LeeT,Pierre-PaulD,etal.Theroleofthrombospondin-1inhumandisease.JSurgRes.2004，122(1):135-142.［3］TurunenN,P,SoiniY.Apoptosisin5gallbladde

7、rcarcinomasanddysplasias,itsrelationtotheexpressionofcaspases3,6and8andapoptosisregulatingproteinsbcl-2,mcl-1andbax.HistolHistopathol.2000Jan;15(1):53-60.［4］BaenzigerNL,BrodieGN,MajerusPW.Athrombin-sensitiveproteinofhumanpla