老年人食管鳞状细胞癌、腺癌和化生论文

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1、老年人食管鳞状细胞癌、腺癌和化生论文蔡建春，刘棣，刘凯华，张海萍，钟山，夏宁邵【关键词】癌,鳞状细胞；食管肿瘤,腺癌；微卫星重复；聚合酶链反应；barrett食管；化生；增生；序列分析摘要:目的评估老年人食管鳞状细胞癌(ESCC)、食管腺癌(EADC)和Barrett化生不典型增生腺癌序列DNA微卫星的改变。方法应用稀释性PCR技术检测老年人ESCC、EADC和Barrett化生不典型增生腺癌序列中D2S123、D3S1616、D3S1300、BATRII、D5S346、D17S787和D18S

2、617个位点DNA微卫星的改变。结果在非稀释DNA中，23例老年人ESCC和18例老年人EADC微卫星不稳定性(MSI)的频率分别是47.8%(11/23例)和38.9%(7/18例)，杂合性丢失(LOH)的频率分别是26.1%(6/23例)和16.7%(3/18例).freel的组织3片，在显微镜下按照HE染色切片上的标记进行显微切割，取出组织，装入0.5mL离心管。余下蜡块组织再行常规切片、HE染色并与切割前的切片比较（图1）。切割不同蜡块时均清洁石蜡切片机刀头和刀片，显微切割不同组织均用不

3、同的洁净器械。采用蛋白酶K（10mmol/LTrisHCl,pH8.0,100mmol/LKCl,2.5mmol/LMgCl2,0.45%Tg/mL蛋白酶K）消化方法提取基因组DNA：组织在50μL蛋白酶K消化液中95℃变性10min，常温冷却1h，然后在65℃孵育1h，最后在95℃变性10min去除多余的蛋白酶K，混合物离心（5000r/min，5min），吸出上清液，移至洁净的离心管。DNA质量测定值在1.0723～1.2401D(260nm)/D(280nm),DNA含量为255.36～4

4、06.98ng/μL。8例正常鳞状上皮、Barrett化生上皮、不典型增生上皮和EADC组织的DNA分别按1∶100，1∶1000，1∶5000，1∶10000和1∶50000稀释度用三蒸水进行稀释。1.3稀释性PCR和微卫星改变7个微卫星位点是D2S123，D3S1616，D3S1300，BATRⅡ，D5S346，D17S787和D18S61（PCR引物购自美国ResearchGeics公司），分别位于hMSH2，hMLH1，FHIT和TGFβRⅡ基因内，MCCAPC基因之间以及p53和DCC

5、基因邻近。每个不同稀释度（1∶100，1∶1000,1∶5000,1∶10000，1∶50000）的PCR扩增反应均包含1μLDNA模板，0.4μCi:r32PATP放射性标志的微卫星引物，0.2mmol/LdNTP,10mmol/LTrisHCl,pH8.3,.freelmol/LMgCl2,50mmol/LKCl和0.4U的Taq多聚酶，反应总体积为10μL。PCR反应条件为：95℃5min→95℃30s→58℃40s→72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸2min。A:切割前;B:显

6、微切割后.图1Barrett食管不典型增生上皮(HE染色×200)（略）Fig1EpithelialdysplasiainBarrettesophagus(HEstaining×200)图1Barrett食管不典型增生上皮(HE染色×200)（略）1EpithelialdysplasiainBarrettesophagus(HEstaining×200)图2Barrett食管不典型增生上皮被显微切割后(HE染色×200)（略）Fig2Epithelialdysplasiaaftermicrodi

7、ssection(HEstaining×200)PCR引物序列如下：D2S123上游引物：5’ACATTGCTGGAAGTTCTGGC3’D2S123下游引物：5’CCTTTCTGACTTGGATACCA3’D3S1616上游引物：5’CTCCCTACCTGAAAAGATGC3’D3S1616下游引物：5’TCGGCTTAAAGACTCAGTTTATT3’D3S1300上游引物：5’AGCTCACATTCTAGTCAGCCT3’D3S1300下游引物：5’GCCAATTCCCCAGATG3’BA

8、TRII上游引物：5’CTTTATTCTGGAAGATGCTGC3’BATRII下游引物：5’GAAGAAAGTCTCACCAGGC3’D5S346上游引物：5’ACTCACTCTAGTGATAAATCGG3’D5S346下游引物：5’GTTTCCATTGTAGCATCTTGAC3’D17S787上游引物：5’NEDTGGGCTCAACTATATGAACC3’D17S787下游引物：5’TTGATACCTTTTTGAAGGGG3’D18S61上游引物：5’ATTTCTAAGAGGACTCCCAA