资源描述：
《ctab法提取红麻总dna技术优化与issr和srap扩增效果》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、CTAB法提取红麻总DNA技术优化与ISSR和SRAP扩增效果2007年第29卷第4期中国麻业科学PLANTFIBERSCIENCHI垒文章编号:1673—7636(2007)04—0179—05CTAB法提取红麻总DNA技术优化与ISSR和SRAP扩增效果徐建堂,祁建民,方平平,李爱青,林荔辉,吴建梅,陶爱芬.(1.福建农林大学生命科学学院,福建福州350002;2.湖南农业大学,湖南长沙410128)摘要:红麻基因组总DNA的提取纯度,关系到新型分子标记ISSR,SRAP的PCR扩增效果.经反复实验,对CTAB法提取红麻总DNA技术进
2、行了改进,即采集足量的红麻嫩叶,提取时加入B一巯基乙醇,提取过程中使用2.5%CTAB,最后用预冷的l无水乙醇沉淀DNA.OD~o/OD2踯比值检测结果为平均1.824.而且DNA得率也较高.证明用此法提取的DNA能完全满足ISSR和SRAP分析的要求和获得较理想的效果,本文还讨论了高质量DNA提取应注意的有关技术环节.关键词:红麻;DNA提取;CTAB优4E;PCR扩增中图分类号:$563.5文献标志码:A.生物体基因组DNA的提取是进行基因操作和遗传分析的基础,关系到分子标记扩增质量的优劣.最初总DNA的提取方法是先将核蛋白体提取出来
3、,然后再从核蛋白体上提取出DNA,这种方法称为两步法【11.近十几年来采用一步法,即在破碎细胞时加入去污剂或去污剂与苯酚等试剂,使核蛋白体解离,然后使蛋白质变性沉淀,分离提取DNA;或使DNA沉淀进入固相而与液相中的蛋白质,多糖等杂质分离.RNA的去除主要采用RNaseA消化,最后用乙醇或异丙醇沉淀DNA.目前,植物总DNA的提取方法主要有两种:即CTAB法及SDS法.SDS法操作简单,温和,但所得DNA含糖类杂质较多.CTAB法的最大优点是能很好地消除糖类杂质,所以对于麻类作物含酚类物质及糖类物质较高的植物材料,采用CTAB法是比较理想
4、的;该方法的另一个优点是在提取的前期能得到高含量的DNA与RNA,可根据实验的需要,分别进行纯化,如只需要DNA则可用RNaseA水解掉RNAI冽.红麻叶片中含有大量的单宁,酚类,果胶,多糖及色素,蛋白质含量也较高,较难提取出高质量的DNA.而且越老的叶片中这些杂质含量越高,易与DNA结合形成粘稠的胶状复合物,既难溶解又影响PCR扩增效果.红麻基因组DNA的提取质量对以PCR为基础的ISSR,SRAP新型分子标记的效果有重要影响.如果提取DNA纯度较差,不但容易导致本身的降解,而且无法扩增出条带.同一种方法提取不同的植物材料效果也不同,所
5、以必须优化一种适合特定作物的总DNA提取的最佳方法,才能获得理想的分子标记效果.为此笔者总结了周东新[21,曹德菊DI等人在红麻作物总DNA提取的经验和教训,在此基础上参考了国内外有关文献f4.5,6,t&9】,并考虑了新型分子标记ISSR和SRAP分子技术对DNA样品的质量要求,进一步对利用CTAB法提取红麻总DNA进行了改进,优化后CTAB法对提高红麻DNA提取质量取得了良好的效果.'1材料与方法1.1供试材料以红麻福红952,福红2号,金光1号,粤743,H029,非洲裂叶等六个品种的嫩叶为材料.收稿日期:2007-03—2
6、1基金项目:国家自然科学基~(30571188),948引进项目2006-G18C(B)作者简介:徐建堂(1978一),男,硕士,主要研究方向:生化与分子生物学.通讯作者:祁建~(1948一),男,研究员.主要研究方向:作物遗传育种生物化学与分子生物学.180中国麻业科学1.2试验试剂提取缓冲液100mMTris?I-ILl50ml1.4MNaC140.908g20mMEDTA20ml加蒸馏水至500ml,高压灭菌l5%CTABCTAB粉末15g加蒸馏水至100ml,高压灭菌TE10mMTris.HCI(pH=8.o1lmMEDTA(pH
7、=8.01氯仿/异戊醇:24:175%乙醇10mg/mlRNaseA1.3DNA提取技术步骤及方法优化1MTrish(pH=8.0)NaCl0.5MEDTA(pH=8.012%PVP10g第29卷采集供试红麻品种苗期幼嫩叶片,称取不带水珠叶片5.0g,供研磨提取之用.倒入足量的液氮一次性把嫩叶研磨成粉末(保持研磨的叶片粉末不融化),迅速装入50ml离心管后,先加入200～250mlB一巯基乙醇,再加入15ml提取缓冲液混匀,置于4o【=冰箱中保存,直到研磨完所有的样品.加入在65℃下预热的15%CTAB2.5nll,轻轻混匀,在65℃水浴
8、30～40min,冷却至室温.加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),温和上下颠倒离心管20～30次,8000rpm室温离心10min或者4000rpm室温离心20min,充分离心可确保杂质的有
