ctab—硅珠法提取dna实验流程

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1、CTAB—硅珠法提取DNA实验流程前言:实验是要求非常严谨的过程,每个一步骤都可能对后面的操作产生很大影响,乃至影响后面的结果.一步错,步步错,每一个操作的失误都可能导致整个实验的失败.事实求是与踏踏实实的作风是每个做实验的人必备的基本品质.永远记住,任何弄虚作假的行为都是可耻的.在这个充满学术腐败的科学界,保持自己的纯真.                    谨记1.材料的采集采取植物的嫩叶,可以用硅胶干燥保存,也可以用冰袋,主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回,置于-70℃冰箱保存.2.CTAB—

2、硅珠法提取DNA实验流程各加入液体的配制：1、CTAB提取液：2%（W/Vg/mol）CTAB；5%（W/Vg/mol）PVP；1.4mol/lNaCl；20mmol/LEDTAPH=8.0；l00mmol/lTris-HClPH=8.0； 2%(V/V)巯基乙醇(临时加入)配制量：500ml配制方法：(1)计算所需组分量CTAB       10g  需热磁力搅拌PVP       25g  NaCl       40.908g  EDTA.Na2.2H2O    3.7224g  调PH=8冷却为常温时(母液)Tris

3、       6.057g  (2)称取CTAB10g，NaCl40.908g，PVP25g置于500ml烧杯中(3)加入约300ddH2O(双蒸水)充分磁力搅拌溶解(注意：EDTA和PVP较难溶，加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止)(4)量取20mlEDTA(0.5mol/lPH=8)，50mlTris-HCl(1mol/lPH=8)溶液于烧杯中，均匀混合(5)将烧杯溶液定容至500ml后，高温高压灭菌(6)室温保存。0.5mol/LEDTA配制组分浓度：0.5mol/lEDTA，PH=8配制量：500ml配制

4、方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O，置于500ml烧杯中  (2)加入约400mlddH2O.用热磁力搅拌器充分搅拌  (3)用NaOH调节PH值到8，约用10克固体NaOH  (4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至PH=8  (5)加ddH2O将溶液定容到500ml  (6)高温高压灭菌后，室温保存NaOH溶液的配制组分浓度：5mol/lNaOH配制量：100ml配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中(2)加入ddH2O定容到100ml100mmol/lTris-HCl的配制组分浓度：mmol/l

5、Tris-HCl，PH=6.4配制量：250ml配制方法(1)称取3.025克Tris于250ml烧杯中. (2)加入约200mlddH2O充分搅拌溶解. (3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3ml (4)将溶液定容至250ml (5)用棕色瓶分装于4度冰箱中 (6)如使用，用水浴加热溶解.2、氯仿-异戊醇的配制：配制方法(1)简单的体积混合，既要求比例为24：1即可  (2)储存于棕色玻璃瓶子中  (3)置于4度冰箱以便日后使用3总的实验流程3.1．总的DNA的提取：1.  在10ml离心管（eppendorf

6、管）中加入4mlCTAB提取液及80ul巯基乙醇，在65℃水浴锅中预热2.  取材料1-2g于研钵中，加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状，转至预热的CTAB提取液中，用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发.放回水浴中保温30分钟，保温过程中轻晃几次，保持摇匀.3.  取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷却到室温，加入等体积的4ml氯仿-异戊醇（24：1），轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成乳状液，然后4℃下离心12000rpm10min，轻轻将上清液吸取1ml于1.5ml离心管，放于-20℃冰箱中备用.各加入液的用途

7、：（1）去污剂：CTAB：可将细胞膜裂解，使DNA释放到提取液中，同时也使组织匀浆中的蛋白质变性.EDTA：能与DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，不能降解从细胞中释放的DNA.（2）还原剂巯基乙醇：它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.（3）氯仿—异戊醇：它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将DNA与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开除去.（4）RNase：它可去除核酸中的RNA，只留下DNA.3.2．总DNA的纯化操作步骤：1.  取出1.5ml离心管，内含所取DNA，加入100ul硅珠悬

8、浮液（此液要求先行涡旋再使用），使用涡旋振荡器大约15s，使之充分混匀，于室温静置10分钟，再振荡5秒，后离心：8000rpm15s4度，去除上清液得到硅珠——核酸复合物.2.  将复合物用镊子一次打两个，打成液状，使之完全分散，加入漂洗液1ml，再涡旋充分混匀，后离心8000rpm15s弃掉上清液.3