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《ctab--硅珠法提取dna实验操作》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、前言:实验足要求殊纟产後的过程，每个一步骤都可滋对后曲的操作产唆很丈影响，73至彫响后面的猪果，一步籍，步步籍，每一个燥作的失誤都可饨导致整个实验的失氏事实朮是鸟腊绪实实的作風是每个做实脸的人必备翁屋凉品质，永迄杞住，代何弄疾作假的行签都足可耻的，在运个充满禽术扁畋的科禽界•保持自己的絶命谨记1•材料的采集釆取植物的嫩叶,可以用硅胶干燥保存，也可以用冰袋,主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回，置于-70°C冰箱保存.2.CTAB—硅珠冻提取DNA卖殓流程各加入液体的配制：1、CTAB提取液：2%(W/Vg/mol)CTAB；5%(W/Vg/mol)PV
2、P：1.4mol/lNaCl；20mmol/LEDTAPH=8.()；100mmol/lTris-HClPH=8.0；2%(V/V)藐基乙醇(临吋加入)配制量：500ml配制方法：(1)计算所需组分量CTAB10g需热磁力搅拌PVP25gNaCl40.908gEDTA.Na2.2H2O3.7224g调PH=8冷却为常温时(母液)Tris6.057g(2)称取CTAB10g,NaCl40.908g,PVP25g置于500ml烧杯中⑶加入约300dd出0(双蒸水)充分磁力搅拌溶解(注意：EDTA和PVP较难溶，加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止)(4)量取20mlE
3、DTA(0.5mol/lPH=8),50mlTris-HCl(lmol/1PH=8)溶液于烧杯中，均匀混合(5)将烧杯溶液定容至500ml后，高温高压灭菌(6)室温保存。0.5mol/LEDTA配制组分浓度：O.5mol/1EDTA,PH=8配制量：500ml配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O,置于500ml烧杯中(2)加入约400mldd出0.用热磁力搅拌器充分搅拌(2)用NaOH调节PH值到8,约用10克固体NaOH(3)在溶液冷却后，再用NaOH调节至PH=8(4)加ddH2O将溶液定容到500ml(5)imj温咼压灭菌后，室温保存NaOH溶液
4、的配制组分浓度：5mol/1NaOH配制量：100ml配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中(2)加入ddH2O定容到100ml100mmol/1Tris-HCl的配制组分浓度：mmol/1Tris-HCl,PH=6.4配制量：250ml配制方法⑴称取3.025克Tris于250ml烧杯中.(2)加入约200mlddH2O充分搅拌溶解.(3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3ml(4)将溶液定容至250ml(5)用棕色瓶分装于4度冰箱中(6)如使用，用水浴加热溶解.2、氯仿•异戊醇的配制：配制方法(1)简单的体积混合，既要求比例为24：1即可(2)储存于棕色
5、玻璃瓶子中(3)置于4度冰箱以便口后使用3总的卖殓流程3」.总的DNA的提取：1.在10ml离心管(eppendorf管)中加入4mlCTAB提取液及80ul基乙醇，在65°C水浴锅中预热2.取材料1-2g于研钵中，加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状，转至预热的CTAB提取液中，用封口膜将离心管封密以防止疏基乙醇挥发•放回水浴屮保温30分钟，保温过程屮轻晃儿次，保持摇匀.3.取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷却到室温，加入等体积的4ml氯仿-异戊醇(24：1),轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成乳状液，然后4°C下离心12000rpmlOmin,轻轻将上清液吸取l
6、ml于1.5ml离心管,放于-20°C冰箱中备用.各加入液的用途：(1)去污剂：CTAB：可将细胞膜裂解，使DNA释放到提取液中，同吋也使组织匀浆中的蛋白质变性.EDTA：能与DNase的辅助因子结合，使DNase失去活性，不能降解从细胞中释放的DMA.(2)还原剂疏基乙醇：它抑制从细胞屮释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.(3)氯仿一异戊醇：它可把组织匀浆屮变性的蛋白质除去，将D7A与细胞屮的蛋白质、碳水化合物等分开除去.(4)RNase：它可去除核酸中的RNA,只留下DNA.3.2.总DNA的纯化操作步骤：1.取出1.5ml离心管，内含所取DNA,加入lOOul硅珠
7、悬浮液(此液要求先行涡旋再使用)，使用涡旋振荡器大约15s,使之充分混匀，于室温静置10分钟，再振荡5秒，后离心：8000rpm15s4度，去除上清液得到硅珠一一核酸复合物.2.将复合物用锻子一次打两个，打成液状，使之完全分散，加入漂洗液lml,再涡旋充分混匀，后离心8000rpm15s弃掉上清液.3.重复上一步一次.4.用70%的lml乙醇将硅珠一一核酸复合物漂洗两次.每次涡旋充分混匀后，离心8000rpm15s,弃上清液，打散，最后用lml无水乙醇再漂洗一次，用涡旋混匀离心8000rpm15s,然后将离心管管口打开倒置在吸
