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时间:2017-11-11
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1、CTAB—硅珠法提取DNA实验流程前言:实验是要求非常严谨的过程,每个一步骤都可能对后面的操作产生很大影响,乃至影响后面的结果.一步错,步步错,每一个操作的失误都可能导致整个实验的失败.事实求是与踏踏实实的作风是每个做实验的人必备的基本品质.永远记住,任何弄虚作假的行为都是可耻的.在这个充满学术腐败的科学界,保持自己的纯真. 谨记1.材料的采集采取植物的嫩叶,可以用硅胶干燥保存,也可以用冰袋,主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回,置于-70℃冰箱保存.2.CTAB—硅珠法提取DNA实验流程各加入液体的配制:1、CTAB提取液
2、:2%(W/Vg/mol)CTAB;5%(W/Vg/mol)PVP;1.4mol/lNaCl;20mmol/LEDTAPH=8.0;l00mmol/lTris-HClPH=8.0; 2%(V/V)巯基乙醇(临时加入)配制量:500ml配制方法:(1)计算所需组分量CTAB 10g 需热磁力搅拌PVP 25g NaCl 40.908g EDTA.Na2.2H2O 3.7224g 调PH=8冷却为常温时(母液)Tris 6.057g (2)称取CTAB10g,NaCl40.908g,PVP25g置于500ml烧杯中(3)加
3、入约300ddH2O(双蒸水)充分磁力搅拌溶解(注意:EDTA和PVP较难溶,加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止)(4)量取20mlEDTA(0.5mol/lPH=8),50mlTris-HCl(1mol/lPH=8)溶液于烧杯中,均匀混合(5)将烧杯溶液定容至500ml后,高温高压灭菌(6)室温保存。0.5mol/LEDTA配制组分浓度:0.5mol/lEDTA,PH=8配制量:500ml配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O,置于500ml烧杯中 (2)加入约400mlddH2O.用热磁力搅拌器充分搅拌 (3)用NaOH调节PH值到8,约用10克
4、固体NaOH (4)在溶液冷却后,再用NaOH调节至PH=8 (5)加ddH2O将溶液定容到500ml (6)高温高压灭菌后,室温保存NaOH溶液的配制组分浓度:5mol/lNaOH配制量:100ml配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中(2)加入ddH2O定容到100ml100mmol/lTris-HCl的配制组分浓度:mmol/lTris-HCl,PH=6.4配制量:250ml配制方法(1)称取3.025克Tris于250ml烧杯中. (2)加入约200mlddH2O充分搅拌溶解. (3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3ml (4)将溶液定容至250ml
5、(5)用棕色瓶分装于4度冰箱中 (6)如使用,用水浴加热溶解.2、氯仿-异戊醇的配制:配制方法(1)简单的体积混合,既要求比例为24:1即可 (2)储存于棕色玻璃瓶子中 (3)置于4度冰箱以便日后使用3总的实验流程3.1.总的DNA的提取:1. 在10ml离心管(eppendorf管)中加入4mlCTAB提取液及80ul巯基乙醇,在65℃水浴锅中预热2. 取材料1-2g于研钵中,加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状,转至预热的CTAB提取液中,用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发.放回水浴中保温30分钟,保温过程中轻晃几次,保持摇匀.3. 取出Eppenedorf管.置于冰
6、上迅速冷却到室温,加入等体积的4ml氯仿-异戊醇(24:1),轻微混合均匀且充分,使其彻底地混合成乳状液,然后4℃下离心12000rpm10min,轻轻将上清液吸取1ml于1.5ml离心管,放于-20℃冰箱中备用.各加入液的用途:(1)去污剂:CTAB:可将细胞膜裂解,使DNA释放到提取液中,同时也使组织匀浆中的蛋白质变性.EDTA:能与DNase的辅助因子Mg2+结合,使DNase失去活性,不能降解从细胞中释放的DNA.(2)还原剂巯基乙醇:它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.(3)氯仿—异戊醇:它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去,将DNA与细胞中的蛋白质、碳水化合
7、物等分开除去.(4)RNase:它可去除核酸中的RNA,只留下DNA.3.2.总DNA的纯化操作步骤:1. 取出1.5ml离心管,内含所取DNA,加入100ul硅珠悬浮液(此液要求先行涡旋再使用),使用涡旋振荡器大约15s,使之充分混匀,于室温静置10分钟,再振荡5秒,后离心:8000rpm15s4度,去除上清液得到硅珠——核酸复合物.2. 将复合物用镊子一次打两个,打成液状,使之完全分散,加入漂洗液1ml,再涡旋充分混匀,后离心8000rpm15s弃掉上清液.3
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