体外构建的htahsp70bcg冲激的树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用论文

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1、体外构建的HTAHSP70BCG冲激的树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用论文孙光，郭连英，沈洁，刘丹丹，施广霞，钱振超【摘要】目的观察体外构建的榄香烯复合瘤苗抗原卡介苗热休克蛋白70复合物（HTAHSP70BCG）诱导的树突状细胞疫苗的抗肿瘤效应。方法来源于小鼠的肝癌HcaF榄香烯复合疫苗的抗原（HTA）与卡介苗来源的HSP70（HSP70BCG）在体外构建成HTAHSP70BCG复合物，用GMCSF和IL4诱导树突状细胞（DCs），分别用HTAHSP70BCG、HTA和HSP70BCG对其冲激。用MTT法检测该DCs刺激的全脾

2、细胞的增殖活性及被刺激的脾细胞的细胞毒活性。用流式细胞仪检测DCs表面CD86和CD40的表达。结果体外构建HTAHSP70BCG可以诱导DCs成熟.freelorEffectsInducedbyDendriticCellVaccinePulsedoreffectsinducedbydendriticcells(DCs)pulsedorantigenfromelemenebotumorcellvaccineheatshockprotein70ofBCG(HTAHSP70BCG).MethodsTumorantigenpeptid

3、esfromelemeneboHcaFcell(HTA)binedediumulatingeffectsonunseparatedsplenocytesandthecytotoxicityofthesplenocytesactivatedeter.ResultsPulsingofHTAHSP70BCGresultedinDCsmaturation,characterizedbyupregulationofCD86andCD40.ProliferationindexofunseparatedsplenocytesfromHTA

4、HSP70BCGgroupDCspulsedaturationandthematureDCscouldactivatesplenocytestogeneratemorepotentspecificantitumoreffect.Keyorvaccine；Antitumoreffects0引言热休克蛋白（Heatshockproteins，HSPs）是细胞受到应激时新合成或合成增加的一组蛋白质，被称为分子伴侣，在细胞抗原的加工和提呈方面起重要作用［1］。分枝杆菌HSPs与相关抗原形成融合蛋白可诱导特异性T细胞反应，分枝杆菌HSP70富含

5、T、B细胞表位，是细胞免疫的重要靶点，可被用来作为疫苗的载体［2］。现已证明，从肿瘤细胞来源的HSPs肿瘤肽复合物可诱导抗肿瘤免疫应答［3，4］，HSP70BCG能通过树突状细胞（Dendriticcell，DC）表面TLR4途径诱导DC成熟［5］。本实验采用榄香烯处理的HcaF肿瘤抗原（TumorantigenofHcaFtreatedene，HTA）在体外与卡介苗热休克蛋白70（HSP70BCG）构建成肿瘤疫苗HTAHSP70BCG，探讨其抗瘤效应及机制。1材料1.1实验动物与瘤株BALB/C近交系小鼠，引自中国医学科学院北

6、京药物研究所。HcaF肝癌细胞株由本校凌茂英教授惠赠。L929小鼠成纤维细胞瘤细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所张友会教授惠赠。1.2主要试剂RPMI1640（GIBCO，USA）；胎牛血清、rmIL4、rmGMCSF（Sigm）；FITC抗小鼠CD40、PE抗小鼠CD86抗体（SanDiego，CA）；ADP(TrinityBiotech，Ireland)。2方法2.1HTAHSP70BCG的体外构建按本室常规方法制备榄香烯复合瘤苗，细胞浓度调至1×108/ml，用电动匀浆器研磨制成细胞匀浆，超速离心100000g，取

7、上清组分作为粗制肿瘤抗原（HTA）。超声碎BCG菌，超速离心后取上清，用ADP亲和层析法［6］分离卡介苗HSP70，提取物经SDSPAGE电泳和I1640（含20ng/mlIL4和20ng/mlGMCSF）培养液将其浓度调到1×106/ml，在37℃、5%CO2条件下培养，第3天换液，第6天收集不粘附细胞为骨髓树突状细胞(不成熟树突状细胞),将其浓度调至1×106/ml，分别加入HSP70BCG、HTA、HTAHSP70BCG至终浓度25μg/ml，培养24h，收集细胞做细胞表型分析和冲激全脾细胞。2.3DC对全脾细胞的刺激作用

8、按本室常规方法获取全脾细胞，全脾细胞浓度调至4×106/ml，不同处理的DC浓度为4×105/ml，各取100μl加入96孔板培养，于72h以MTT法测定增殖活性，以刺激指数为指标，其计算公式为：刺激指数（