肿瘤转移关键酶论文

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1、肿瘤转移关键酶论文李燕杰，李吉学，彭清忠，汤国营，林艳丽，郭瑞锋，朱厚础【关键词】,肝素裂合酶Cloningoffulllengthheparanasegeneandexpressionoffunctionalheparanaseinmammaliancells【Abstract】AIM:Toexploretheexpressioncharacterofheparanasebyisolatingthefullencodedgeneandexpressingthefunctionalenzymeinmammaliancells.METHODS:ycHis,transfecteditintoCOS

2、7cellsandCHOcellsandthenscreenedtheCHOcellsanentlyexpressedheparanaseintheselectedmedium.RESULTS:Theactivityofheparanaseinthemammaliancelllysatedetecteduchhigherthanthatintheculturemedium.ThemolecularmassoftheheparanaseproteinexpressedinthetransfectedCOS7andCHOcellsedium.ThepositiveCHOcellsexpressin

3、gactiveheparanaseisscreened,avarietyofsources.【Key），反转录试剂盒（ImPromIITMReverseTranscriptionSystem），质粒提取试剂盒均购自Promega公司；凝胶回收纯化试剂盒购自Qiagen公司；HeparanDeagradingEnzymeAssayKit购自日本TAKARA公司.限制性内切酶PstⅠ，XhoⅠ，T4DNA连接酶，PCR扩增所用试剂为TAKARA公司产品；培养基RPMI1640，胎牛血清，Zeocin，脂质体LIPOFECTAMINE2000购自Invitrogen公司；mouseAnticMycA

4、ntibody和AntiMouseIgGHRP购自Invitrogen公司.1.2方法1.2.1分离乙酰肝素酶蛋白编码基因及测序鉴定上游引物ATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGCGCT，下游引物TCAGATGCAAGCAGCAACTTTGGCAT，由塞百盛公司合成.以人胎盘cDNA文库为模板，进行PCR.PCR条件为：94℃3min，变性进入循环；94℃30s，56℃30s,72℃30s，30个循环后72℃继续延伸5min.8g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后采用Promega公司的回收试剂盒纯化PCR产物，直接克隆入pGEMT载体，送联合基因公司测定基因序列.1.2.2构建乙酰肝素

5、酶真核表达载体pCDNA4/MycHisHPA使用含有PstI和XhoI酶切位点的引物CTGCAGATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGCGCT，CTCGAGTCAGATGCAAGCAGCAACTTTGGCAT扩增乙酰肝素酶cDNA片段，将此片段和真核表达载体pCDNA4/MycHis分别用PstⅠ和XhoⅠ进行酶切消化，切胶回收，于16℃连接过夜，转化TOP10感受态细胞.挑取阳性克隆提取质粒，用酶切和测序法鉴定目的基因.1.2.3转染COS7细胞采用脂质体法转染，具体方法如下：培养细胞生长到90%～95%汇合时，将50μL无血清DMEM培养基与0.8μgpCDNA4/MycHisHP

6、A质粒混合,50μL无血清DMEM培养基与2.5μL脂质体混合，室温下孵育5min，然后将以上二者混合，室温下孵育20min.待脂质体和质粒的混合微粒形成，将此混合液接种于培养孔内，轻摇培养板，混匀.在37℃，50mL/LCO2条件下的培养箱培养.72h后收集细胞用于检测.1.2.4筛选阳性细胞株①Zeocin的敏感浓度测定：CHO细胞培养至80%汇合，以每孔2000个细胞接种培养板；细胞贴壁后，加入Zeocin，使每行孔内Zeocin的终浓度分别为0，10，20，30，40和50mg/L；继续培养80h，期间每10h计算培养孔中的细胞数.作出生长曲线，以抑制细胞生长浓度的一半为最低敏感浓度，

7、筛选浓度定为敏感浓度的2倍.②使用Zeocin筛选阳性细胞株：pCDNA4/MycHisHPA质粒转染CHO细胞，方法同上.48h后传代细胞.继续培养细胞直到细胞贴壁，使细胞生长密度不超过25%汇合度，倒出培养基，加入含有筛选浓度Zeocin的选择培养基继续培养；18h后，将细胞以3×103/cm2的密度传代至选择培养基中，每4日换选择培养基1次；然后采用有限稀释法进行单克隆筛选.将阳性集落转移到