肿瘤坏死因子α对背根神经节电压门控性钠通道表达的影响

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1、肿瘤坏死因子α对背根神经节电压门控性钠通道表达的影响：臧颖何昕华庞瑞萍魏绪红信文君周利君李永勇刘先国【摘要】【目的】探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对背根神经节(DRG)电压门控性钠通道(Nav1.3)表达的影响，并探讨其在神经病理性疼痛形成中的可能作用。【方法】采用免疫荧光组织化学方法和免疫荧光细胞化学方法，观察外源性重组TNF(rrTNF)对在体大鼠和离体培养的大鼠DRG神经元Nav1.3表达的影响。【结果】①不损伤任何神经，仅在大鼠坐骨神经周围给予100pg/mL的rrTNF可引起病理性疼痛的产生，并引起L5和L4DRG神经元内Nav1

2、.3显著上调;②在分离培养的正常成年大鼠DRG神经元表面直接给予100pg/mLrrTNF显著诱导Nav1.3表达上调，其上调分布于DRG神经元的胞膜和胞浆，并以胞膜上调更为显著。【结论】TNF-α在神经病理性疼痛形成中具有重要作用，外周神经损伤可能通过DRG内TNF-α的上调，促发Nav1.3异常表达，由初级感觉传入异常兴奋，参与病理性疼痛的产生。【关键词】肿瘤坏死因子-α;钠通道;背根神经节;病理性疼痛　Abstract：【Objective】TodiscusstheeffectofTNF-αontheexpressionoftetrao

3、dontoxin-sensitiveNav1.3channelsindorsalrootganglion(DRG)andfurthertoexplainthemechanismresidedinthedevelopmentofneuropathicpain.【Method】-7：00PM。为尽量减轻动物在实验中的痛苦，所有实验步骤均按照实验动物的相关使用原则操作。　　1.2慢性坐骨神经周围给予rrTNF模型(PSTmodel)　　此模型是在大鼠清醒状态下，通过导管在其坐骨神经周围反复多次给予rrTNF得以实现。如图1所示，大鼠在4g/L戊巴比

4、妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉下，左后肢背侧经备皮、消毒后，沿坐骨神经走行方向做一斜向中线的斜行切口，用玻璃分针小心分离出后肢中段水平的坐骨神经，将一端连有PE-10导管(6cm)的无菌明胶海绵(15mm×5mm×9mm)包裹于已分离出来的坐骨神经周围，并将导管固定于周围肌肉上，用3-0医用缝合线逐层缝合切口，暴露于切口外的导管埋置于皮毛中，通过导管分别于手术中及术后1、2d给予200?滋LrrTNF或假手术组仅给予200?滋LrrTNF的溶剂——1g/L牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)盐水，给药结束后用烧热的

5、镊子封闭管口。　　1.3免疫组织化学　　1.3.1动物灌注和标本处理　　大鼠在按实验设计饲养规定的时间后，用乌拉坦(氨基甲酸乙酯，1.5g/kg)腹腔注射麻醉，先后用生理盐水和40g/L多聚甲醛溶液(pH7.2～7.4，4℃)对动物进行主动脉灌流固定30min。解剖动物取出同侧L4和L5DRG，多聚甲醛溶液后固定3h，再于300g/L蔗糖溶液中脱水3d。标本经冰冻切片后收集于24孔板内，并置于4℃冰箱短暂保存。具体实验方法参见我们的近期报道[7]。　　1.3.2免疫荧光组织化学染色及定量分析　　将DRG冰冻切片用0.01mol/LPBS洗3次

6、，每次5min，加入封闭液1h，吸去封闭液并加入抗-Nav1.3抗体(1：100;Sigma，St.Louis，USA)。4℃过两夜后，吸去一抗，加入标记Cy3的IgG(1：300;JacksonImmunoResearch，PA)，避光作用1h后贴于载玻片上，于荧光显微镜下观察并拍照。免疫染色结果的定量分析是通过计数每张切片上的Nav1.3免疫活性(Nav1.3immunoreactivity，Nav1.3-IR)阳性细胞的百分比获得的。具体实验方法和定量分析参见我们的近期报道[7]。　　1.4成年大鼠DRG神经元的分离培养　　正常雄性SD

7、大鼠，麻醉、低温下，迅速取出腰骶部脊柱，尽量剪净脊柱两侧的肌肉组织。把脊柱从正中剪开，分成左右两半，放入解剖液中(DMEM液)。从解剖液中取出脊柱，用镊子取出脊髓，轻轻取出双侧椎间孔中的L4、L5、L6DRG放入含解剖液的培养皿中。用巩膜剪剪除DRG上的神经根，吸干培养皿中的解剖液，尽量剪碎DRG。然后将剪碎的DRG放入消化液(1.25g/L胰酶+1.25g/L胶原酶)37°C振荡消化15～20min，加入血清终止消化。静止5min，取上清液于另一离心管中，800×g离心5min。弃上清，加入培养基(DMEM-F12+100g/L胎牛血清)重

8、悬沉淀，并滴于24孔板或盖玻片中，置CO2培养箱(体积分数为95%空气+5%CO2)孵育培养3～5d。　　1.5免疫细胞化学染色及定量分析　　将培养于盖玻片上的细胞