自发性癫痫大鼠脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调

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1、第1卷第4期2006年11月中国科技论文在线SCIENCEPAPERONLINE291自发性癫痫大鼠脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调于娜，郭凤，杜娃，姚维凡，蔡际群（中国医科大学，药学院药物毒理学教研室，沈阳110001）摘要：[目的]对照研究自发性癫痫大鼠（SER）和正常Wistar大鼠（WTC）脑内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型钠通道α亚基mRNAs与蛋白表达情况。[方法]提取枕叶皮质、齿状回及海马CA1和CA3区组织总RNA，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及建立限制性内切酶图谱检测Ⅰ、ⅡA、ⅡN、ⅢA和ⅢN的表达，应用免疫荧光定位与表达α3亚基ⅢN蛋白。[

2、结果]SER枕叶皮质、齿状回及海马CA1和CA3区总钠通道的表达略高于WTC，但均无显著差异（P>0.05），SERⅢ型钠通道在海马的表达高于WTC（P<0.01），酶切图谱显示ⅢN型钠通道表达水平有明显上调。[结论]SER脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调。关键词：钠通道；mRNA；RT-PCR；限制性内切图谱检测；自发性癫痫大鼠中图分类号：R96文献标识码：A文章编号：1673–7180(2006)04–0291–5自发性癫痫大鼠（spontaneouslyepilepticrat，大鼠在麻醉状态下断头，迅速取脑，液氮速冻，[1]SER）为双基因突变大

3、鼠，由tremor（tm）大鼠杂用冰冻切片机切成厚度达400μm的冠状切片。在双[2]合子（tm/+）和zitter（zi）大鼠纯合子（zi/zi）交目显微镜下从脑切片的四个不同部位进行针孔取样[3]配得到。生后8周，SER出现自发性的癫痫大发作（直径为1.4mm）：大脑枕部皮质、齿状回及海马和小发作，其对于抗癫痫药物的反应同癫痫患者类CA1和CA3椎体细胞层。将标本置于-80℃备用。[4]似，是研究遗传性癫痫的理想动物模型。用TRIzol（GIBCOBRL）提取总RNA（按厂家说明大鼠脑内存在着几种不同的钠通道α亚基操作），电泳检测完整性，测定浓度后-70℃保存

4、。cDNAs，由至少5种不同的基因编码：NaChⅠ、1.3逆转录[5,6]NaChⅡ、NaChⅢ、NaCh-G和NaCh6。其中第一链cDNA按RT-PCR试剂盒（大连宝生物）NaChⅡ、NaChⅢ基因还存在2种亚型，称为A（成说明书，用Oligo(dT)15-18引物合成。反应条件：42℃[7]熟型）和N（新生儿型）。由于神经元兴奋性形成30min、99℃5min，逆转录产物4℃保存。除RNA过程中电压依赖性钠通道起着重要作用，而且是一样本外加所有试剂的反应管作为空白对照，以等量些抗癫痫药物作用的主要位点，因此我们采用的DEPC水代替RNA样本。RT-PCR及建

5、立限制性内切酶图谱方法和免疫荧光1.4聚合酶链反应（PCR）技术研究SER和WTC脑内皮质、齿状回及海马CA1PCR1，以β-actin（上游5′-ATCATGTTTGAG和CA3区Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型钠通道及其亚型mRNA和蛋ACCTTCAACA-3′，下游5′-CATCTCTTGGTC白的表达情况，为寻找与钠通道有关的癫痫相关基GAAGTCCA-3′）为内参照(308bp)，靠近大鼠脑钠因及癫痫的基因治疗提供理论依据。通道序列的5´端626个碱基的片段用一组引物进行1材料和方法扩增，该组引物对大鼠5个序列（Ⅰ、ⅡA和N、1.1实验动物ⅢA和N）均完全符合。引物序列为：

6、引物15′-CATSER和WTC各5只，体重150克左右，雌雄不TCCTCCAGAGATGGTGTC-3′，引物25′-TAT限，均由中国医科大学实验动物部提供。TCCTCAGGTTGCCCATGAA-3′。为了提高退火1.2标本及总RNA制备的特异性，退火温度采取渐降方式（touch-down第1卷第4期292自发性癫痫大鼠脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调2006年11月PCR），在16个循环过程中从68~60℃每个循环降低照用PBS缓冲液代替一抗。用FITC标记的羊抗兔二0.5℃，最后14个循环退火温度维持在60℃。抗孵育切片,37℃1小时，PBS漂

7、洗5分钟3次后用PCR2，除不加入β-actin引物外，其余条件与Hochest32228做核复染，用PBS漂洗5分钟3次。甘PCR1相同。油-PBS缓冲液封片后荧光显微镜观察。PCR3，以GAPDH（上游5′-AATGCATCCTGC1.7统计学分析ACCACCAA-3′，下游5′-GTAGCCATATTCATT各组结果以均数±标准差（x±s）表示，两组间GTCATA-3′）为内参照（515bp），另设计一组引物比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。专门分析Ⅲ型钠通道mRNA的表达，分别为：引物32结果5′-AAGTCGGAATCGGAAGACAGTGT

8、-3′，引