近红外光谱法快速检测牛奶中氯霉素残留

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1、近红外光谱法快速检测牛奶中氯霉素残留氯霉素(CAP)是一种广谱抗生素，大剂量反复使用，会造成CAP在牛奶及奶制品中的残留。氯霉素对胃、肠、肝脏等有一定的损害作用，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎，因此各国对食品中氯霉素残留量都制定了严格的限制标准。目前我国采用的氯霉素药物残留的检测方法有微生物法、毛细管区域电泳法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等，但是上述分析方法都有如下缺点：一连串物理或化学操作会破坏样品；样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐。近红外光谱(NIR)分析技术是20世纪70年代后逐

2、渐兴起的一种新型快速定量分析方法，它具有前处理简单、无污染、方便快捷、不破坏检材、可在线检测等优点。被普遍用于食品、药品和石油工业、环境科学，生物学和医学等领域。近红外光谱中有效信息率低，对复杂样品进行近红外光谱分析需从复杂、重叠、变动的光谱中提取微弱信息。本实验采用多元散射校正作为光谱数据的预处理方法结合偏最小二乘法(PLS)建立牛奶中氯霉素残留的定量分析校正模型，并用所建模型对预测集样品中的氯霉素含量进行预测，取得较好的效果。表明该方法在食品安全控制方面有很大的应用前景。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器鲜奶；氯霉素标准

3、品(纯度99.4%)；MPA型傅立叶变换近红外光谱仪；LC-10ATvp高效液相色谱仪；SPD-10A紫外检测器；XYJ80-2电动离心机1.2算法原理1.2.1偏最小二乘法偏最小二乘μ是一种广泛应用的多元统计数据分析方法，其在自变量空间和应变量空间分别寻找某些线性组合(潜变量)，并使得两个变量空间的协方差最大。与传统多元线性回归模型相比，偏最小二乘回归的特点是：能够在自变量存在严重多重相关性的条件下进行回归建模；允许在样本点个数少于变量个数的条件下进行回归建模；偏最小二乘回归在最终模型中将包含原有的所有自变量；偏最小二乘回

4、归模型更易于辨识系统信息与噪声(甚至一些非随机性的噪声)。1.2.2多元散射校正(MSC)MSC可以有效剔除样品颗粒度、填装密度、湿度等物理因素导致的散射影响，从而提高光谱的信噪比。它利用在样品光谱与理想光谱之间建立线性关系的方法消除散射带来的影响。1.3训练集和预测集样品的制备和选取用双蒸水分别配制浓度10、30、50、70μg/ml氯霉素贮备液，将贮备液用牛奶稀释成0.1426μg/ml到4.8857μg/ml浓度范围内的64个样本，为了更加接近于实际分析样品，配制后的牛奶在4℃冰箱内放置72h。以高效液相色谱法测得的浓

5、度作为理论含量。PLS法要求校正集样品的含量必须涵盖预测集，因此64个样品中，先选择1个最高和1个最低含量的样本,然后随机选择34个样本作PLS法的训练集,其余28个样本作为预测集。1.4光谱采集将样品分别装于1mm石英样品池中在12500～4000cm-1间扫描，分辨率为8cm-1。扫描次数为32次。以InGaAs检测器检测光谱数据，每个样品重复扫描3次，取平均值。由图1可以看出，牛奶中成分在近红外谱区均有吸收，且水峰(7100～7500cm-1以及5000～5500cm-1)干扰严重，氯霉素在牛奶中的限量较低，用经典光谱

6、分析方法难以进行定量分析。1.5高效液相色谱法1.5.1色谱条件流动相：乙腈-5mmol/L磷酸氢二铵溶液(20:80，V/V)；色谱柱：汉邦C18(150mm×4.6mm，5μm)；固相萃取小柱：AGTCleanertmC18SPE(3ml/500mg)；波长：278nm；流速：1.0ml/min；柱温：常温。在上述色谱条件下，CAP和内标的保留时间分别为17.99min和16.39min，杂质和内源性物质无干扰，典型色谱图见图2、3.1.5.2牛奶样品预处理方法在10g牛奶样品中加入25μg/ml非那西丁溶液20μl作为

7、内标(IS)。提取过程是在样品中加入5mol/L盐酸溶液0.1ml，再加入25ml乙酸乙酯。经振荡、离心，取出上层提取液，用氮气吹干。残余物用20ml4%NaCl溶液溶解，并用20ml正己烷去除脂肪。将盐溶液加在已用5ml甲醇活化并用5ml水冲洗过的C18固相萃取小柱(3ml/500mg)上，2ml40%甲醇冲洗，2ml甲醇洗脱，60℃氮气吹干。残余物用100μl流动相溶解。2结果与分析2.1光谱区域选择对模型准确性的影响近红外光谱区主要反映分子中含氢基团的倍频与合频,光谱重叠严重，如采用全谱建模计算量巨大，而且与样品的组成

8、或性质间缺乏相关关系。为了找到最有用的光谱区域，可以将测定的氯霉素含量数据与样品的光谱数据进行关联，找出相关系数较大的光谱区域。从表1中可以看出，在6101.9～5446.2cm-1光谱区域，内部交叉验证均方差(RMSECV=0.0816)较低，内部交叉验证决定系数(R2=99.63)较高