灰绿曲霉对绞股蓝皂苷微生物转化及生物活性研究

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1、doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201603017灰绿曲霉对绞股蓝皂苷微生物转化及生物活性研究陈良华1，翁梦婷2，秦江2，沈瑞池1，陈清西2，明艳林收稿日期：2016-03-08录用日期：2016-06-02基金项目：国家自然科学基金(81274149)；厦门市科技创新项目(3502Z20132009)；厦门市对台科技合作项目(3502Z20141041)*通信作者：xmyanlin@gmail.com*（1.福建省亚热带植物研究所福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建厦门361006；2.厦门大学生命科学学院，福建厦门361005）摘要：以福建绞

2、股蓝为材料，经乙醇溶剂提取和分离获得绞股蓝皂苷，利用灰绿曲霉微生物转化绞股蓝皂苷，通过测定绞股蓝皂苷和灰绿曲霉转化产物抗癌、抗酪氨酸酶和抗氧化活性，比较绞股蓝皂苷经微生物转化修饰后生物活性变化差异．结果表明：灰绿曲霉转化产物对肝癌细胞SMMC7721有体外抑制作用，半抑制率IC50值为91.66mg/mL，而绞股蓝皂苷抗癌效果不强；绞股蓝皂苷对酪氨酸酶活力具有较强抑制作用，半数抑制率IC50值为0.14mg/mL，而灰绿曲霉转化产物抗酪氨酸酶较弱，绞股蓝皂苷对酪氨酸酶的抑制作用属于可逆抑制，其抑制类型为混合型抑制作用；绞股蓝皂苷在0.2mg/mL浓度下对DNA氧化损伤有保护作

3、用，而灰绿曲霉转化产物在2mg/mL浓度下显示保护作用．研究结果说明绞股蓝皂苷微生物修饰后，抗癌作用效果增强，对酪氨酸酶抑制作用和DNA氧化损伤作用减弱，本研究为利用微生物转化法筛选抗癌绞股蓝皂苷奠定基础．关键词:福建绞股蓝；微生物转化；酪氨酸酶抑制；抗肝癌；抗氧化中图分类号:Q356.1文献标识码：A绞股蓝[Gynostemmapentaphyllum(Thunb)Makino]为葫芦科绞股蓝属植物．绞股蓝种类繁多，全世界共有14个种2个变种，我国是绞股蓝分布和分化中心[1]．2001年国家林业局保护司《国家重点保护野生植物名录》中，把绞股蓝列入国家卫生部药食同源保健食品开

4、发原料．绞股蓝其化学成分研究始于上世纪70年代，目前报道已分离到主要绞股蓝皂苷(Gypenoside，GYP)已达到169种之多[2]．绞股蓝皂苷结构上与人参皂苷具有类似主骨架的达玛烷型结构，属于四环三萜皂苷，导致绞股蓝皂苷许多药理作用与人参皂苷相似，其中主要有抗肿瘤[3]、降血脂血糖[4]、保肝护肝[5]和防止衰老[6]等药理作用．微生物转化技术是天然产物结构修饰和筛选新先导化合物研究的有效途径．Ko等[7]对各种糖苷水解酶水解三醇型皂苷混合物进行研究，利用来源于米曲霉(Aspergillisoryzae)的半乳糖苷酶和青霉菌(Penicilliumsp.)的乳糖酶粗酶液水

5、解大量三醇型皂苷混合物，分别产生大量的小分子皂苷Rg2和Rh1．三萜皂苷衍生物抗肿瘤活性与化学结构有直接相关性，构效关系研究表明化学结构中主要影响因素包括：母核构型、侧链糖基数量和位置、羟基的数量和位置等方面．利用微生物转化对同类型骨架的皂苷的侧链基团修饰，生成低毒高活性的新型三萜皂苷或苷元成为皂苷相关研究，目前对人参皂苷[8]、三七皂苷[9]和甘草皂苷[10]等微生物转化进行结构改造取得较大进展,但绞股蓝皂苷微生物转化研究报道甚少．朴香兰等[11]研究表明保加利亚乳杆菌对绞股蓝提取物的微生物转化产物比原绞股蓝提取物具有更强的抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖作用，保加利亚乳杆

6、菌能够使绞股蓝成分发生转化．本课题组前期研究报道[12]利用黑曲霉和构巢曲霉两种真菌对福建绞股蓝皂苷微生物转化，转化产物对肝癌细胞SMMC7721和Bel7402增殖具有抑制作用．本文研究灰绿曲霉对绞股蓝皂苷微生物转化，测定灰绿曲霉转化产物和原绞股蓝皂苷的抗癌、抗酪氨酸酶和抗氧化活性等生物活性，比较绞股蓝皂苷经微生物转化修饰后活性变化情况，为绞股蓝皂苷结构修饰和应用奠定基础．1材料与方法1.1材料福建绞股蓝于秋季采集自福建南靖产区，灰绿曲霉(Aspergullusglaucus)为厦门大学生命科学学院龙敏南教授课题组致赠．旋转蒸发仪购自Eyela公司，酶标仪（MULTISKA

7、N,MK3）、CO2培养箱购自美国Thermo公司，高效液相色谱(HPLC)购自美国Agilent公司．肝癌细胞SMMC7721购自中科院上海生化与细胞所；新生牛血清购自HyClone公司，蘑菇酪氨酸酶(MushroomTyrosinase)、L-多巴（L-DOPA）、胰蛋白酶和四甲基偶氮唑盐[MTT，溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑]购自Sigma公司，pBKS载体购自上海生工生物工程有限公司；其他试剂为国产分析纯，使用的蒸馏水为去离子重蒸水．1.2方法1.2.1绞股蓝皂