人参皂苷微生物转化的代谢调控研究

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1、学校代码：10246学号：082103149硕士学位论文人参阜苷微生物转化的代谢调控研究院系：药学院专业：药物化学姓名：张春燕指导教师：冯美卿副教授指导小组成员：周伟讲师完成日期:2012年5月12日复旦大学硕士学位论文目录MM3Abstract5中英文对照7frb"8第一部分钙离子在人参皂苷微生物转化中的调控作用13第一章钙离子及钙信号转导对！^^生物转化的影响131实验材料142实验方法163?结果与分析193.1钙离子浓度对sp.229-7菌体生长的影响193.2胞外钙离子浓度对胞内钙离子浓度的影响203.3钙离子浓度对人参

2、皂苷Rd转化率及Rd产量的影响223.4钙离子浓度对P-葡萄糖苷酶活力的影响243.5钙信号转导途径的初步确定254舰27第二章p-葡萄糖苷酶的分离纯化及其活性研究281实验材料291实船法303.结果与分析353.1sp.229-7中P-葡萄糖苷酶的分离纯化353.1.1sp.229-7中P-葡萄糖苷酶的检测方法353.1.2sp.229-7产酶曲线的确定363.1.3sp.229-7菌体破壁效果检测373.1.4p-葡萄糖苷酶硫酸铵盐析最佳饱和度的确定373.1.5疏水层析初步分离纯化(PhenylSepharose

3、?6FastFlow柱)383.1.6离子交换层析分离纯化（QS印haroseXL柱）403.1.7凝胶过滤层析分离纯化（Superdex20010/300GL柱）423.2sp.229-7中p-葡萄糖苷酶的酶学性质研究453.2.1sp.229-7中p-葡萄糖苷酶的动力学常数453.2.2温度对P-葡萄糖苷酶活力和酶稳定性的影响453.2.3pH对中P-葡萄糖苷酶活力和酶稳定性的影响463.3钙离子对P-葡萄糖苷酶的影响473.3.1不同浓度钙离子对P-葡萄糖苷酶活性的影响473.3.2钙离子对P-葡萄糖苷酶在不同温度下酶活力和酶

4、热稳定性的影响......483.3.3钙离子对卩-葡萄糖苷酶在不同PH下酶活力和酶pH稳定性的影响..…4951第二部分发酵条件对人参皂苷微生物转化的影响521实验材料522实验方法543结果与分析573.1sp.229-6代谢途径的研究571人参皂苷微生物转化的代谢调控研究3.2底物浓度对人参皂苷CK转化的影响603.3细胞膜通透性对人参皂苷CK转化的影响623.3.1表面活性剂的选择623.3.2表面活性剂最佳加入时间的确定633.3.3表面活性剂最佳浓度的确定643.4诱导剂对人参皂苷CK转化的作用65

5、3.4.1诱导剂最佳浓度的确定653.4.2诱导剂最佳加入时间的确定654.??66第三部分总结与展望68詩翅70综述75发表论文及参加会议情况84SCM85ItM862复互大学硕士学位论文摘要人参皂苷是人参的主要药理活性成分，对心脑血管、神经系统、抗辐射、抗炎、抗肿瘤等作用独特。人参皂苷在天然中含量极低，CompoundK甚至在天然中并不存在，由于其复杂的特殊化学结构，目前主要采用温和专一的微生物转化法制备。微生物转化即利用微生物代谢过程中产生的酶系对底物进行催化反应，增加活性产物含量或产生新的结构化合物。因而，在酶的合成及活性水平上对人

6、参皂苷的微生物代谢进行调控研究在理论和工业生产应用上兼具重大意义。本实验室从野山参土壤中分尚蹄选得到了转化菌株Paecilomycesbainiersp.229,可以将三七茎叶总皂苷（其中，人参皂苷Rtn含量为62.08%)转化为人参皂苷CompoundK，转化率达到72.9%，但是存在底物投料浓度偏低的问题，仅为0.5%。为了提高底物投料浓度，将菌种进行了诱变，并以高浓度底物进行筛选，获得了能耐受高浓度底物的突变株sp.229-6和sp.229-7。诱变株sp.229-6的转化终产物依然是CompoundK，本研究对sp.229-6转化人参皂苷Rhm代谢途径及

7、调控因素进行了研究，通过筛选酶诱导剂、改变细胞膜通透性等手段，得到最优发酵条件：种子瓶生长36h，接种，同时添加4%。的吐温80，培养24h之后，加入0.5%。的底物作诱导，继续生长24h，以1.5%或1.0%投料，装液量30ml/250ml摇瓶，28°C，lOOrmiiT1摇床转化72h，控制pH值为5.0。在底物投料浓度为1.5%,最终转化率可达43.63%;投料量为1.0%，最终转化率达到61%。同样发酵体系下，与sp.229相比，s/7.229-6转化生产CK总产量可以提升67-80%，具有良好的工业应用价值。突变株sp.229-7的转化产物为单一的Rd

8、,在对其发酵条件优化过程