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1、人胚胎胰腺发育中巢蛋白阳性细胞表达变化【摘要】目的:探索人胚胎发育过程中胰腺巢蛋白(nestin)阳性细胞表达的变化。方法:应用免疫组织化学EnVision法,检测30例人胚胎胰腺组织中巢蛋白阳性细胞的表达及分布变化。结果:各胎龄段(10～37w)胰腺均有巢蛋白阳性细胞表达,存在于胰岛、间充质和血管中,在腺泡、导管中未发现阳性细胞,胚胎发育晚期阶段(29～37w)巢蛋白阳性细胞高于其它胎龄组。结论:在人胚胎胰腺组织中存在着巢蛋白阳性细胞,该细胞主要分布于胰岛和间充质中。随着胎龄的变化,胰腺巢蛋白
2、阳性细胞数也发生了变化。【关键词】巢蛋白;人胚胎;胰腺;阳性细胞【中图分类号】R321【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-015-27胰腺干细胞移植可以用来治疗糖尿病,寻找可供移植的胰腺干细胞是近年来人们关注的热点。巢蛋白(nestin)是1990年由lendahl等鉴定出来的,属于第Ⅵ族中间丝蛋白,Mr为240000,是神经干细胞和祖细胞的标志物,也是胰岛干细胞的标志之一[1-2]。虽然已有学者对胚胎胰腺中nestin阳性细胞的表达做过研究,但仅局限在12～16周的
3、胚胎胰腺[3-4]。对于胚胎胰腺发育过程中的阶段性表达及分布变化尚未见报道。本实验用免疫组织化学EnVision二步法,对31例10～37w人胚胎胰腺中nestin的表达进行了检测,了解其在不同胎龄胰腺中表达的差异性,探讨其生物学意义,为临床胰腺移植供体的选择和胰腺干细胞提取提供形态学资料。1材料和方法1.1材料和分组收集因故终止妊娠的正常胎儿31例,分成3组。A组10～19w10例,B组20～28w11例,C组29～37w10例,各胎儿均取其胰尾,入Bouin液固定20～40h,石蜡包埋制成5
4、μm厚的连续切片。1.2方法nestin免疫组织化学采用EnVision二步法,nestin单克隆抗体为SantaCruz公司产品,试剂盒为DAKO公司产品。主要染色步骤:常规石蜡切片脱蜡至水,3%H2O2室温孵育20min,封闭内源性过氧化物酶,92～100℃枸椽酸缓冲液抗原修复20min,冷却20min;1:100工作浓度的nestin单克隆抗体4℃冰箱过夜;PBS冲洗3次,每次5min;滴加EnVision液室温孵育30min;PBS冲洗3次,每次5min;DAB显色,镜下控制时间,自来水
5、冲洗;苏木精复染,酒精梯度脱水,二甲苯透明并中性树胶封片。空白对照以0.01mol/LPBS代替一抗血清进行免疫组织化学反应。OlympusCX31光学显微镜下观察并数码相机拍照。71.3判断标准为每张切片连续观察5个高倍视野,在含有胰岛的高倍视野中计数100个细胞中nestin阳性细胞数,取其平均值。所有数据采用SPSS11.5forWindows统计软件进行随机区组方差分析。计量数据以均值±标准差(-x±s)表示。2结果nestin阳性细胞呈深棕黄色,定位于细胞质。图1胎胰10w原始胰管和间
6、质nestin阳性细胞EnVision法×400Fig1positivestainingofnestininprimitivepancreaticductingandmesenchymalcell(10weekoldembryo),EnVision,×400图2胎胰16wnestin阳性细胞EnVision法×100Fig2Positivestainingofnestininembryonicpancreas(16weekoldfetus),EnVision,×40072.1A组:胚胎胰腺10w
7、时出现了原始胰管,这些原始胰管nestin全部弱阳性表达,但间充质中出现大量的nestin强阳性细胞,表达率达99%以上,因未观察到胰岛,故该例未列入统计范围(图1)。11w后胰腺内结缔组织增多,出现未形成明显腺腔的腺泡,胰岛大、小不一,14周之后胚胎胰腺中可见明显的小叶结构,能分辨出腺泡、导管和胰岛。胰岛中出现较多阳性细胞,阳性细胞分布散在,周边和中心均有;阳性部位在细胞内呈现波形分布,在核周围聚集,呈放射状发散。在胰腺的间充质、血管中也有许多阳性细胞,但未发现在腺泡和导管中的阳性细胞(图2)
8、。B组:胚胎20～28w中可见胰岛的数量在增加,胰岛中有nestin阳性细胞,腺泡和导管中无阳性细胞,间充质中存在阳性细胞,分布于血管内皮细胞、血管壁的平滑肌细胞中。C组:29～37w胚胎中可见胰腺的外分泌部和内分泌部结构更明显,胰岛数量多,nestin阳性细胞比前阶段增多,间充质、血管中均出现nestin阳性细胞,存在于血管内皮和外层结构中,腺泡中无阳性细胞,导管中上皮外有阳性细胞(图3)。图3胎胰32wnestin阳性细胞EnVision法×100Fig3Positivestainingof
