小鼠胚胎发育过程中内皮和平滑肌标志物的表达变化

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1、分类号：——密级：——UDC：——论文编号：——硕士学位论文MASTERTHESIS小鼠胚胎发育过程中内皮和平滑肌标志物的表达变化李颖佳大连医科大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。论文作者签名：蚕撤位指导教师签名：霆盏!L[：签字日期：丑年土月

2、旦日小鼠胚胎发育过程中内皮和平滑肌标志物的表达变化硕士生姓名：指导教师：指导小组：专业名称：李颖佳韩雅玲教授康建副主任技师齐岩梅博士内科学摘要研究背景和目的血管增殖失调是临床常见的病理过程，如动脉粥样硬化、同种异体移植后血管重塑、支架内再狭窄、经皮球囊血管成形术等。探讨血管平滑肌细胞(Vascularsmoothmusclecells．VSMCs)的起源有助于增生性血管病的治疗。以往认为胚胎的VSMCs起源于神经嵴和胚胎中胚层：新近发现VSMCs还可能起源于成体骨髓干细胞或祖细胞、外周血的单核细胞、骨骼肌的成体千细胞和内皮细胞

3、(Endotheliumcells，ECs)等。YamashitaJ等的体外研究证实，胚胎干细胞来源的胎肝激酶．“Fetalliverkinase．1，Flk．1)，即血管内皮生长因子受体．2阳性细胞在血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)作用下可分化为血管ECs，在血小板源性生长因子．BB作用下可分化为VSMCs，因此认为．Flk．1阳性细胞是血管ECs和VSMCs的共同前体，然而该理论尚缺乏在体证据支持。我们通过对胚胎血管行Flk．1、血小板内皮细胞粘附分子(Plate

4、letendothelialcelladhesionmolecule．1，PECAM-l／CD31)、Ⅷ因子相关抗原及平滑肌c【．肌动蛋白(SmoothMusclen．actin，SMc【．actin)免疫组织化学染色，探讨上述标志物在血管形成初期的表达时相及空间位置关系，为VSMCs的起源提供新的在体实验依据。Flk一1主要分布于ECs、造血细胞及其前体细胞，已有报道Flk．1最早出现于小鼠胚胎6．5d，在ECs及造血细胞的发育中发挥重要作用：在血管新生生理过程或肿瘤等病理过程中也可观察到Flk—l呈高表达，但小鼠植入前胚胎

5、是否表达Flk．1迄今尚未见报道。本实验拟初步探讨Flk．1在小鼠植入前胚胎发育过程中的表达规律及其在胚胎发育中的作用。实验方法1．获取8．5～18．5d胚胎：将母鼠分别放入公鼠笼内过夜、交配。次日清晨检查到白色阴道栓者为怀孕鼠，该天记为怀孕第0．5d。在母鼠怀孕第8．5～18．5d，处死母鼠。取出胚胎。2．获取植入前胚胎：母鼠腹腔内注射孕马激素10U，44～48h后注射人绒毛膜促性腺激素5u，随后将其分别放入公鼠笼内过夜、交配。12h获取单细胞期胚胎，36h获取2细胞期胚胎，48h获取4细胞期胚胎，60h获取8细胞期胚胎，8

6、4～96h获取囊胚。从超排卵母鼠的输卵管冲出单细胞期胚胎到8细胞期胚胎，从子宫中冲出桑椹胚和囊胚。3．8．5～18．5d胚胎标本置4％多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)中室温固定3h，按常规脱水后石蜡包埋，制各横断面5um厚度连续切片，挑选胸腔部分和腹腔部分的主动脉切片染色。4．植入前胚胎经3g／L聚乙烯基吡咯烷酮／磷酸盐缓冲液(Polyvinylpyrrolidone／phosphatebufferedsaline，PVP／PBS)中洗涤，2．5％PFA室温固定15rain，置PVP／PBS液4℃保存，待用

7、。5．8．5～18．5d胚胎切片行苏木素．伊红染色，观察背主动脉形态学变化。6．8．5～18．5d胚胎切片行Flk．1、CD31、Ⅷ因子相关抗原及sMa—actin免疫组织化学染色，观察胚胎发育过程中，背主动脉ECs及VSMCs标记物的表达变化。7．收集植入前各期胚胎20个，采用mRNACaptureKit试剂盒可捕获总mRNA，行Flk．1的反转录一聚合酶链(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT．PCR)反应，观察Flk．1的表达变化规律。8．植入前各期胚胎采用微滴操作

8、行Flk·1全胚免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察Flk—l的表达及定位。9．将8细胞期胚胎旨于含5mg／LFlk．1中和抗体的胚胎培养液中培养12h后，加入绿色荧光标记的羊抗大鼠二抗，观察透明带是否能通过抗体等大分子物质。10．取8细胞期胚胎随机分3组，实验组加入Flk一