巢蛋白过表达调控细胞增殖促进小鼠胚胎心脏和脑的生长发育

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文巢蛋白过表达调控细胞增殖促进小鼠胚胎心脏和脑的生长发育Nestinoverexpressionpromotestheembryonicdevelopmentofheartandbrainthroughregulationofcellproliferation课题来源：学位申请人纪小珍{旨导教师安靓教授名称肿瘤学类型学术型层次硕士研究生所在学院肿瘤研究所2014年5月15日广州业养养专培培硕士学位论文IUlIIIlllllli[1lUllllillllMIIIIIIIlY2618479巢蛋白过表达调控细胞增殖促进小鼠胚胎心脏

2、和脑的生长发育硕士研究生：纪小珍指导教师：安靓摘要研究背景与目的巢蛋白(nestin)归为第六类中间丝蛋白，主要分布在细胞浆内。巢蛋白在神经系统、胰腺、心肌、骨骼肌、牙齿、肾上腺、睾丸、肿瘤中均有表达。1985年Hockfield和Mckay首先发现，nestin在胚胎大鼠脊髓神经管神经前体细胞中表达。nestin在胚胎的早期发育如神经管的发育、原肠胚和一些器官的形成过程中高表达，随着发育的成熟，nestin表达逐渐下降，最后消失，在成体细胞中不表达，但在组织发生损伤的时候，部分细胞可以观察到重新表达nestin。最近越来越多的研究发现nestin不仅在中

3、枢神经系统肿瘤中表达，在乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、胰腺肿瘤以及黑色素瘤等多种肿瘤中也有表达。项鹏等发现，nestin可以在恶性血管内皮细胞瘤、胰腺腺泡癌和胃肠间质瘤中表达，并且其表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关。体外研究表明，nestin参与细胞增殖、迁移和分化等过程。Li-chunwei等观察到抑制nestin表达后对星型胶质细胞瘤的生长有明显的抑制作用，但Ki一67的表达并不减少，可见nestin与细胞的增殖无直接关系。另外有研究发现，nestin可通过Cdk5／p35信号通路增强细胞生存能力，抑制凋亡发生。体内研究发现，nestin基因敲除

4、后使斑马鱼脑和眼发育障碍，主要由于细胞凋亡增加引起；而在nestin敲减后的小鼠大脑皮层中，神经元的形成明显减少，主要由于细胞增殖减少所致。然而，也有研究发现，nestin可能和糖皮质激素受体结合后使P13K活性增强，中文摘要通过下游的一系列酶促反应促进细胞进入增殖周期。已有研究发现，PDGF，Thrombin等细胞生长因子可增强nestin的表达从而调控细胞的增殖和／或存亡。例如，PDGF(曾报道可促进肾小管上皮细胞的增殖)可上调nestin的表达；体外实验表明Thrombin可上调nestin的表达从而促进星型胶质细胞的增殖。这些发现说明了细胞生长因子

5、信号通路可调控nestin的表达，从而促进细胞的增殖和存活。以上研究表明，nestin的体内功能复杂，nestin是促进细胞的增殖或者是抑制其凋亡仍然存在争议。Nestin作为神经干细胞的标志物，其表达模式特别，一般情况下只表达于未分化成熟的细胞，细胞分化成熟后其表达下降甚至不表达。为此，我们提出假设，nestin过表达后能否维持细胞的增殖状态?发育过程中过表达nestin能否影响细胞的正常凋亡?作为研究基因功能的一种重要作用手段，基因过表达技术备受大家青睐。到目前为止，nestin过表达转基因小鼠体能功能的研究迄今尚无相关的报道。为了进一步研究nesti

6、n的体内功能，我们课题组前期已经成功构建了nestin过表达转基因小鼠。前期的工作中发现，nestin过表达后可促进肝脏损伤后肝细胞的再生增殖能力。本课题旨在利用该转基因小鼠研究nestin过表达后对小鼠胚胎发育的影响，以便进一步探讨nestin的体内功能。研究内容与方法1．nestin在转基因动物胚胎主要器官中的表达水平采用PCR、Q．PCR、Westernblotting方法从DNA、mRNA以及蛋白水平检测nestin转基因小鼠胚胎主要器官(脑、心脏、肝脏、肺、皮肤)中外源基因neStin的表达情况。2．nestin对转基因小鼠胚胎生长的影响收集E1

7、1．5至E18．5发育阶段的nestin转基因小鼠和野生型小鼠胚胎标本，肉眼观察比较转基因小鼠和野生型小鼠胚胎生长发育的差异。HE染色比较转基因鼠和野生型鼠胚胎各器官的形态学差异。硕士学位论文3．nestin对转基因鼠心脏和脑组织增殖及凋亡的影响采用Brdu和TUNEL实验检测转基因小鼠和野生型小鼠胚胎心脏和前脑组织中增殖以及凋亡的细胞差异情况。同时采用免疫组化法检测转基因小鼠前脑组织细胞的分化情况，免疫荧光双标记实验检测前脑组织中增殖的细胞是否为神经干细胞。4．nestin基因过表达对P13K／Akt信号通路的影响采用Westernblotting方法从

8、体内水平检测nestin转基因小鼠胚胎心脏和脑组织中P13K／Ak