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1、蒿芩清胆加减方含药血清诱导Lewis肺癌细胞分化探究（成都中医药大学，四川,成都,610075）【摘要】目的：观察蒿芩清胆加减方含药血清对Lewis肺癌细胞的分化诱导作用,并初步探索其作用机制。方法：蒿芩清胆加减方含药血清,体外培养Lewis肺癌细胞,通过不同浓度血清作用于细胞进行干预.观察给药后细胞形态学变化。用MTT抑瘤实验,琥珀酸脱氢酶（SDH）,乳酸脱氢酶（LDH）的测定,细胞周期的测定,观察细胞分化的情况。结果：光镜下血清组培养瓶中贴壁细胞数量呈减少趋势,以高剂量组细胞形态和数量改变趋势明显。MTT比色法显示含药血清浓度越高,抑制作用越强.SDH活性显示蒿芩清胆加减方
2、血清组系使Lewis肺癌细胞内的SDH活性明显上升,并以高剂量组作用最为明显。LDH活性显示蒿芩清胆加减方血清高剂量组降低细胞内LDH活性最明显。结论：蒿芩清胆加减方含药血清作用于Lewis肺癌细胞株后,细胞具有向正常细胞生理状态分化成熟的趋势。【关键词】蒿芩清胆加减方；Lewis肺癌细胞；分化诱导；含药血清【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】1005-1074(2009)04-0002-028蒿芩清胆汤出自《重订通俗伤寒论》,由青蒿脑、淡竹茹、仙半夏、赤茯苓、青子芩、生枳壳、陈广皮和碧玉散组成。目前对该方抗肿瘤研究不多,黄秀深教授经过长期临床用药发现,该方在
3、与人参,苦参等益气扶正,清热解毒的中药加减化裁后,对肺癌,肝癌等各种恶性癌症有较好的治疗效果。为了解其作用机制,本次实验以诱导Lewis肺癌细胞分化进行研究。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验细胞株Lewis肺癌细胞株由成都中医药大学病理实验室提供。1.1.2实验动物与药品健康SD大鼠,体重200～220g,雌雄各半,由成都中医药大学实验动物中心提供,合格证号：川实动管97(质8)号。蒿芩清胆加减方各中药均购于北京同仁堂成都分店。按常规煎煮法制成每1ml蒿芩清胆加减方含1g生药浓度药液；RPMI1640培养基,GIBCO公司；硝基四唑氮蓝（MTT）,Sigma公司；琥珀酸
4、脱氢酶（SDH）测试盒,乳酸脱氢酶（LDH）测试盒,考马斯亮兰测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。1.1.3给药8将SD大鼠随机分为蒿芩清胆加减方大中小剂量3个组和生理盐水对照组,每组12只.依据文献[1],蒿芩清胆加减方按临床成人（60kg）每天服用生药10倍给SD大鼠灌胃,即每天给药剂量＝人每天治疗剂量×动物等效剂量系数×10倍。每只每次给药2ml（每1ml水煎液含1g生药）,每日2次,连续3d,生理盐水对照组给以同剂量的生理盐水。1.1.4血清的制备末次灌胃前禁食12h.末次灌胃后1h,股动脉采血,静置2h,3000r/min离心15min，分离血清,经56℃,30m
5、in灭活处理后,用0.45um微孔滤膜过滤除菌,置－20℃保存备用。1.1.5血清分组实验共分为5组.将蒿芩清胆加减方含药血清分为小（5％）、中（10％）、大（15％）3组；生理盐水血清组及空白对照组。1.2实验方法1.2.1细胞形态学光镜观察取对数生长期细胞,以0.5×105个细胞/孔接种于6孔板,分组加药,培养6d,常规Wright－Giemsa染色；油镜下计200个细胞,观察其分化成熟度。1.2.2MTT抑瘤实验取对数生长期细胞按2×103/ml接种于96孔培养板中,每组复设6个平行孔,每孔体积200ul，培养24h后给药组依次加入小（5％）、中（10％）、大（15％）含
6、药血清,生理盐水组加等量生理盐水血清，空白对照组加等体积无血清RPMI1640培养基，培养48h,加MTT溶液,继续培养48h后小心吸取培养液,以200ulDMSO溶解结晶,振荡10min后上酶标仪于波长490nm处测每孔的光吸收值（A）,并求出生长抑制率。1.2.3乳酸脱氢酶（LDH）的测定取在对数生长期的Lewis肺癌细胞,分组加药，培养6d后收集细胞,匀浆机破碎，在波长440nm处测每孔的吸光度,按试剂盒说明操作，按公式计算细胞内乳酸脱氢酶活力。1.2.4琥珀酸脱氢酶（SDH）的测定方法同上,在波长600nm处测每孔的吸光度,按试剂盒说明操作，按公式计算细胞内琥珀酸脱氢酶
7、活力。1.2.5流式细胞仪检测细胞周期的变化以1×105个细胞/孔接种于6孔板中,药物处理细胞方法同上，细胞培养6d后,收集细胞(细胞数>106个),用流式细胞仪分析。1.2.6统计学分析所有实验均重复3次.结果采用SPSS12.0统计软件处理,组间计量资料采用单因素方差分析,计数资料采用卡方检验，显著性为P<0.05。2结果2.1光镜形态学观察8在倒置显微镜观察下,空白对照组及生理盐水血清组：Lewis肺癌细胞贴壁生长良好,细胞形态无明显改变。蒿芩清胆加减方血清组培养瓶中贴壁细胞数量呈减少
