液氮低温保存对大鼠主动脉平滑肌细胞和成纤维细胞mhc抗原无影响论文

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1、液氮低温保存对大鼠主动脉平滑肌细胞和成纤维细胞MHC抗原无影响论文杨光蔡振杰张铁柱汪曾炜【关键词】,.freelologous;aortic;histopatibilityantiqensclussⅠAbstract:AIMToinvestigatetheeffectoffluidnitrogencryopreservationontheMHCantigenicityofaortichomo┐grafts.METHODSBymeansofcellcultureandfloetryoothmus-clecellsandfibroblastsofaortichomograf

2、tsofrats.HCⅠantigenandMHCⅡanti-genograftsandcryop-reservedaortichomografts.RESULTSExpressionrateofMHCIantigenofculturedsmoothmusclecellsandfibroblastoothmusclecellsandfibroblastsofaortichomograftsaftercryopreservationoothmusclecellsandfibroblastofaortichomograftsbe-tograftsandcryopreserv

3、edaortichomografts.CONCLUSIONFluidnitrogencryopreservationhasnoobviouseffectontheMHCantigeniacityofaortichomograftsofrats.0引言同种异体主动脉是心血管外科常用的修补和替代材料，其移植后的免疫排斥反应是影响移植远期效果的重用因素［1］.液氮低温保存是同种异体主动脉移植物比较成熟的保存方法，在临床上已被广泛地采用.液氮低温保存方法对同种异体主动脉的抗原性影响是同种异体主动脉移植过程中非常重要的问题，同时也是一个有争议的问题［2-4］，在国内外都未见定量研

4、究.我们采用细胞培养方法和流式细胞仪技术，在细胞水平定量研究低温（-196℃）对大鼠的主动脉平滑肌和成纤维细胞抗原性的影响.1材料和方法1.1实验1:液氮低温保存对培养平滑肌和成纤维细胞MHC抗原的影响1.1.1材料SD大鼠，雌雄不限，体质量150～180g，由本校实验动物中心提供.小牛血清（FCS）（浙江四季青生物制品研究所）;RPMI1640培养基（Gibco公司）;胶原酶（Sigma公司）;胰蛋白酶（Sigma公司）;消化液:12gL-1胰蛋白酶10mL，2gL-1ED-TANa210mL，生理盐水80mL分装，-20℃保存;小鼠抗大鼠MHCⅠ类抗原mAb（mou

5、se-anti-ratMHCⅠantigenmAb）（本校免疫教研室提供）使用浓度:PBS（pH7.4，0.01molL-1）50倍稀释;羊抗小鼠IgG荧光抗体（goatantimouseIgGFITC）（北京军事医学科学院邦定公司）使用浓度:PBS（pH7.4，0.01molL-1）10倍稀释;流式细胞仪（美国Coulter公司）.实验分组:A.正常培养的平滑肌细胞组;B.经液氮低温保存的平滑肌细胞组（4gkg-1）ip麻醉，无菌条件下取出主动脉，按Chamley-Campbell［5］的贴壁方法培养平滑肌细胞和成纤维细胞.细胞生长致密时，以1.2gL-1胰蛋白酶及0

6、.2gL-1EDTANa2消化液消化传代.实验采用第3代传代细胞.用20gL-1胶原酶和2.5gL-1胰蛋白酶消化细胞，PBS（pH7.4，0.01molL-1）洗涤2次（冻存的细胞复苏后用培养液将DMSO置换出，再经PBS洗涤），调整细胞密度为109L-1.取50μl细胞悬液加小鼠抗大鼠MHCⅠ类抗原mAb50μL（工作浓度），4℃条件下保持60min，无关抗体对照组加羊抗兔IgGmAb.洗涤液洗涤2次后加工作浓度的羊抗鼠IgG荧光抗体，充分振摇，4℃保持30min.洗涤液2mL洗涤2次，1000rmin-1离心5min，加固定液1mL上流式细胞仪测定.1.2实验2:

7、液氮低温保存对移植同种异体主动脉MHC抗原的影响1.2.1材料上海雄性SD大鼠100只，供体50只，体质量180～230g，受体50只，体质量250～300g（本校动物实验中心）.显微外科手术器械包（上海手术器械厂），11-0显微外科缝线（杭州富阳医用缝合线厂）.第1抗体:小鼠抗大鼠MHCⅠ类抗原mAb，使用浓度1100（北京邦定公司），小鼠抗大鼠MHCⅡ类抗原mAb，使用浓度150（北京邦定公司），第2抗体:羊抗小鼠IgGABC试剂盒，使用浓度1200（Vec-tor公司）.动物分组:A组，新鲜同种主动脉移植组，B组:低温（-196℃）