液氮保存对人主动脉瓣组织细胞活力的影响

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1、液氮保存对人主动脉瓣组织细胞活力的影响【关键词】氮　　关键词:氮;低温保藏;主动脉瓣;细胞存活;细胞增殖能力;组织培养摘要:目的主要观察液氮（-196℃）保存1～24mo不同时间段的瓣膜组织细胞活力及组织培养细胞生长情况的变化，为临床适用的人同种主动脉瓣的适宜保存期限提供实验依据.方法选取（18～35）岁健康成年男性脑死亡30min内取材的主动脉瓣膜20个.依据保存时间分为10组，Ⅰ组为新鲜对照组，取材后直接供实验用，Ⅱ～Ⅹ组为冷冻保存组，分别为冷冻保存1，3，6，9，12，15，18，21，24mo的瓣膜，每组2个瓣膜共6个瓣叶.冷冻保存组各组瓣膜缓慢降温（1℃&

2、#12539;min-1），液氮中保存，实验时进行快速复温.瓣叶剪为细小组织块，一半置入培养瓶中做组织培养，相差显微镜下观察其组织细胞生长情况;另一半组织块用胰酶消化，光镜下做细胞计数并计算其细胞活力.结果Ⅰ组的组织细胞活力最高（93.8%），Ⅱ～Ⅹ组细胞活力均较Ⅰ组明显减低（67.3%vs93.8%P<0.05）;Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ组细胞活力较Ⅱ～Ⅶ组瓣膜各组明显减低（52.4%vs76.5%P<0.05）.Ⅰ组组织细胞1o瓣膜组织细胞生长较新鲜瓣膜组稍晚，但组织细胞活力仍较高;液氮保存18～24mo瓣膜组织细胞活力明显减低，组织细胞生长缓慢，因此瓣膜组织活性

3、及瓣膜耐久性可能减低.据此可认为，人同种主动脉瓣的适宜保存期限为15mo以内.　　Keyanaorticvalvescryopreservedinliquidnitrogenat-196℃.METHODST18to35yearsoldhealthyadultheartsinafterthedeterminationofbraindeath，GroupⅡtoGroupⅩorespectively.Thefreshvalvesinedimmediatelyafterprocurement.Allthecryopreservedvalvesenm×1mm×1mm.Half

4、ofthetissues-berofviableandnonviablecellsainingtissuesediumcontaining100mL・L-1fetalcalfserumat37℃toobservethecapacityofcellproliferationonthe7thand28thday.RESULTSFreshvalvesseemedtohavethehighestcellsurvivalrateofallthegroups（93.8%）.Incryopreservationgroups，thereGroupⅡtoGroupⅩsh

5、oGroupⅠ（67.3%vs93.8%P<0.05）.ValvesfromGroupⅧ，ⅨandⅩshoGroupⅠtoGroupⅦ（52.4%vs76.5%P<0.05）.CellsinGroupⅠgreofculturecontainerduringthefourthiddleofthesecondostpartofthecontainerbot-tom.InGroupⅧ，ⅨandⅩ，cellsberarkedlydecreasedduringthefourthanaorticvalvetissues.Valvesthatarepreservedf

6、or18ormoremonthshaveloaticdecreaseincellularcapacityofpro-liferation.Accordingtotheresultsofourexperiments，thedurabilityofvalvescryopreserved18ormoremonthsin内取材的主动脉瓣20个.供体心脏均在脑死亡后30min内无菌取出，剪开心脏四腔，4℃生理盐水冲洗3次，用3层无菌塑料袋盛入供心并逐层线扎，冰壶带回，在无菌台上修剪成带瓣管道.实验分为新鲜瓣膜对照组（Ⅰ组）和冷冻保存组（Ⅱ～Ⅹ组）.对照组取材后不入液氮内保存，

7、瓣叶剪下后直接供实验用.冷冻保存组依据在液氮（（196℃）中保存时间分为Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ组，分别为冷冻保存1，3，6，9，12，15，18，21，24mo的瓣膜.每组2个瓣膜共6个瓣叶.　　1.2方法　　修剪备用的带瓣主动脉管道浸入含低浓度抗生素和二甲基亚砜（DMSO）的RPMI1640营养液中，3层无菌耐低温塑料袋分别束扎，外裹锡箔袋，标记时间后，置入4℃冰箱中2h，再置入液氮蒸气中使瓣膜缓慢降温，最后放入液氮中长期保存，降温速率保持在1℃・min-1左右.定期添加液氮，使瓣膜始终保持在-196℃.实验当日取保存不同时间的带瓣管