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1、转染人BTLA基因细胞株的建立及其生物学功能的初步研究论文.freelentofcelllinetransfectedanBTLAgeneandpreliminarystudyonitsbiologicalfunctionAbstractAIM:Toestablish293TcellsexpressinghumanBTLAgene,anovelattenuatorforBandTlymphocyte.METHODS:ThegeneencodinghumanBTLAplifiedbyRTPCRfromPHAactivatedTcells,andthenthetargetge
2、nefragmentafterbeingdigestedHI.TherebinantvectorethodsofMTTandcytometry.RESULTS:ThestableexpressionofhumanBTLAonthetransfectedcelllineetryanalysis.Invitro,293T/BTLAcellshadaninhibitoryeffectontheproliferationofTcellsstimulatedbyantiCD3mAbanddoarkerCD25onthesurfaceofTcellsanddecreasedthese
3、cretionofIFNγandIL10.CONCLUSION:Acellline293T/BTLAstablyexpressingthehumanBTLAproteinhasbeenobtainedanditcanpartiallyinhibittheproliferationandactivationofTcellsinvitro.Keyphocyte;genetransfection;Tcell;proliferation摘要目的:构建B、T淋巴细胞衰减子（BTLA）基因转染的细胞作为免疫原,并探讨该基因转染细胞在体外的生物学功能。方法:通过RTPCR法从经PHA活
4、化的人外周血T细胞中克隆出人BTLA编码区全长基因,经EcoRI和BamHI双酶切后插入逆转录病毒载体pEGZTerm中构建成重组载体pEGZTerm/BTLA。用脂质体法以重组逆转录病毒载体转染293T细胞,并用Zeocin抗生素进行长期筛选;流式细胞术分析BTLA在基因转染细胞膜上的表达;通过MTT法和流式细胞术探讨基因转染细胞在体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测表明BTLA基因转染的293T细胞膜上能稳定地高表达人BTLA蛋白。BTLA基因转染的293T细胞和T细胞体外共培养显示,与未转染的293T细胞相比,该基因转染的细胞能部分地抑制抗人CD3
5、单克隆抗体（mAb）刺激的T细胞增殖;流式细胞术和ELISA法分析揭示,该基因转染的细胞能够下调T细胞表面活化标志CD25的表达并降低IFNγ和IL10的分泌。结论:获得稳定高表达人BTLA基因转染的细胞株。该细胞株在体外对抗人CD3mAb刺激的T细胞的增殖与活化具有部分地抑制作用。关键词B、T淋巴细胞衰减子;基因转染;T细胞;增殖B、T淋巴细胞衰减子（BandTlymphocyteattenuator,BTLA）是2003年新发现的一个重要的负性共信号分子1,属于CD28超家族成员。BTLA表达于外周血成熟的淋巴细胞（包括B细胞、αβT、δγT、CD4+CD25+T细胞
6、）,脾脏巨噬细胞和髓系树突状细胞（DCs）,以及NK细胞呈微弱表达2。研究表明,BTLA对T细胞的活化、增殖起着重要的负调控作用1-3。BTLA相应配体为TNFR超家族中的疱疹病毒入侵介质（HVEM）,其表达于包括T细胞在内的多种免疫细胞表面5。HVEM的胞外段有4个富含半胱氨酸的结构域（CRD1,CRD2,CRD3和CRD4）,其中CRD1可与BTLA结合从而介导负性信号3。有趣的是,HVEM同时又可作为LIGHT（homologoustolymphotoxins,inducible,petesphocyte）4的受体（LIGHT与HVEM的CRD2和CRD3结合5）介
7、导正性信号。BTLA/HVEM/LIGHT这种复杂的相互作用可能有助于实现T细胞的精确调控和适度活化,因此,探讨BTLA的负性调控作用及其机制具有重要的理论意义。由于该新分子尚缺乏相关的研究材料,如功能性抗人BTLA的单克隆抗体（mAb）,对人BTLA的生物学效应与作用机制知之甚少。本研究旨在通过克隆人BTLA编码区全长基因,并建立能稳定表达人BTLA基因的293T细胞株,为研制抗人BTLAmAb提供免疫原;并探讨了其对T细胞增殖与活化的影响。1材料和方法1.1材料293T细胞株购自ATCC公司,由本所保存。克隆载体pMD18
