人cd244基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：日期：2纠三￡幺／苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心

2、、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在——年一月解密后适用本规定。非涉密论文翻论文作者签名。：—辫日期：兰竺蝉导’师签名：t举也El期：兰堕玺斗人CD244基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制中文摘要中又捅姜第一部分人CD244基因克隆及其基因转染细胞株的建立【目的】构建稳定表达人CD244基因转染细胞株。【方法】通过RT-PCR获得人CD244全长

3、cDNA，而后进行PCR扩增；将人CD244全长cDNA重组入逆转录病毒表达载体pEGZ．Term。经测序正确后，通过脂质体法将重组逆转录病毒载体pEGZ．Term／CD244和辅助病毒载体共转染包装细胞293T；收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清，用以感染L929细胞和BaF细胞；采用Zeocin筛选，获得Zeocin抗性的基因转染细胞，并通过流式细胞术检测Zeocin抗性的基因转染细胞GFP和CD244的表达。【结果】成功克隆人CD244全长cDNA，并成功构建稳定表达人CD244的基因转染细胞株L929／CD244和BaF／CD244。【结论】本研究成功构

4、建了稳定表达人CD244的基因转染细胞株，为研制鼠抗人CD244单克隆抗体和研究CD244生物学功能奠定了基础。第二部分鼠抗人CD244单克隆抗体的研制【目的】研制鼠抗人CD244单克隆抗体。【方法】以稳定表达人CD244的基因转染细胞株L929／CD244为免疫原，免疫6～8周龄的BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2／0进行细胞融合，并于HAT选择性培养基中培养；以L929／CD244作为阳性筛选细胞株，并以转染pEGZ．Term空载体的L929／mock细胞株和转染重组逆转录病毒载体pEGZ。TerrrdCD48的L929／CD4

5、8细胞株作为阴性对照，采用流式细胞术对杂交瘤细胞进行筛选；对所得阳性杂交瘤细胞进行多次克隆化培养，直至获得持续稳定分泌特异性鼠抗人CD244单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用快速定性试纸法鉴定单抗亚型；采用间接免疫荧光法检测单抗特异性，并分析所获单抗对健康人PBMC中T细胞和不同来源的肿瘤细胞表面CD244分子的识别。中文摘要人CD244基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制【结果】获得l株持续稳定分泌鼠抗人CD244单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为21F8。经快速定性试纸分析鉴定，21F8的重链为IgM，轻链为K链；腹水形成阳性率为100％，腹水的收获量平均为8ml／只。间接免疫

6、荧光分析结果显示：单抗21F8能够特异性识别人CD244分子，并且能够识别人白血病细胞株U937和健康人PBMC中T细胞表面的CD244分子。【结论】成功获得1株持续稳定分泌鼠抗人CD244单克隆抗体的杂交瘤细胞株。关键词：人CD244；基因转染；单克隆抗体作者：袁桦指导老师：居颂光人CD244基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制英文摘要ConstructionofcelllinestransfectedwithhumanCD244geneandpreparationofmouseanti．．humanCD244monoclonalantibodyAbstractPartIC

7、onstructionofcelllinestransfectedwithhumanCD244geneObjective：ToconstructgenetransfectedcelllinesthatstablyexpressedthehumanCD244．Methods：HumanCD244full—lengthcDNAwasobtainedbyRT-PCRandamplifiedbyPCR；thensubclonedintoretroviralexpressingvector