人lgr5基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制

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1、硕士学位论文论文题目人Lgr5基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制研究生姓名高菲指导教师姓名张学光专业名称免疫学研究方向肿瘤免疫论文提交日期2013年4月人Lgr5基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制中文摘要中文摘要肿瘤是威胁人类生命健康的最重大疾病之一，近年来，随着对干细胞及肿瘤生物学研究的深入，提出肿瘤干细胞（tumorstemcell，TSC）理论。TSC是一种特殊类型的干细胞，具有自我更新能力。TSC在肿瘤的发生发展中起关键性作用，它与肿瘤的转移、抗药性的产生以及治疗后的复发有密切关系。TSC数量少且难以检测，因此对其标记物的研究必将对肿瘤发生发展的了解及

2、肿瘤的临床诊断、治疗都带来深远的影响。近年来，G蛋白偶联受体Lgr5（leucinerichrepeatcontainingGproteincoupledreceptor5）作为新兴的标记分子成为干细胞的研究热点。Lgr5，又名GPR49，HG38，FEX，是G-蛋白偶联受体超家族成员，是由具有18个富含亮氨酸的重复单位和7个跨膜区域组成的大分子蛋白，在人体内分布广泛，大脑、脊髓、乳腺、毛囊、眼睛、生殖器官及胃肠道等都有表达。2007年首次提出Lgr5是结肠肿瘤干细胞表面标志物，是最新发现的Wnt信号传导的目标基因，与肿瘤的形成和发展有很大相关性，可以作为新的治疗靶点。鉴

3、此，研制特异性抗人Lgr5单克隆抗体不仅在理论研究中具有重要意义，而且在临床应用中也具有重要潜在价值。本课题研究旨在通过克隆人Lgr5全长基因，建立CHO/Lgr5稳定基因转染细胞株，以CHO/Lgr5稳定转染细胞株为免疫原，常规免疫BALB/c小鼠，研制获得鼠抗人Lgr5单克隆抗体，同时构建SW480/Lgr5瞬时基因转染细胞株，以研究Lgr5基因对结肠癌细胞株体外生物学特性的影响，为进一步研究人Lgr5分子的生物学特性及其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。本论文分为两个部分：一、人Lgr5基因转染细胞株的构建及Lgr5基因对结肠癌细胞株生物学特性影响的研究【目的】构建p

4、IRES2-EGFP-Lgr5重组表达载体，获得能稳定表达人Lgr5分子的CHO/Lgr5基因转染细胞株，为研制鼠抗人Lgr5单克隆抗体提供免疫原。构建SW480/Lgr5瞬时基因转染细胞株，探讨转染Lgr5基因对结肠癌细胞生物学特性的I中文摘要人Lgr5基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制影响。【方法】运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从结直肠癌组织中获得Lgr5全长基因，经双酶切（XhoI和BamHI）连接入真核表达载体pIRES2-EGFP中，利用脂质体法转染CHO细胞，经G418长期加压筛选获得稳定表达Lgr5分子的CHO基因转染细胞。经RT-PCR

5、、Westernblot、免疫细胞化学法检测Lgr5分子的表达。利用脂质体法将pIRES2-EGFP-Lgr5重组表达载体转染SW480细胞，经Westernblot、免疫细胞化学法检测Lgr5分子的表达。CCK-8法和悬滴实验分析Lgr5对结肠癌细胞增殖率和成球能力的影响，划痕实验分析Lgr5对结肠癌细胞迁移能力的影响。【结果】（1）成功克隆人Lgr5全长基因，构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Lgr5，并构建稳定表达人Lgr5的基因转染细胞株CHO/Lgr5；（2）获得SW480/Lgr5瞬时基因转染细胞株，转染Lgr5基因的结肠癌细胞体外增殖速度加快，形成的细

6、胞球大而紧密，迁移能力下降，由此提示Lgr5基因转染对结肠癌细胞的生物学行为有一定的影响。二、鼠抗人Lgr5单克隆抗体的研制及Lgr5在结直肠癌组织中的表达及其临床意义【目的】研制鼠抗人Lgr5单克隆抗体，分析Lgr5在结直肠癌组织中的表达及其临床意义，为进一步探讨人Lgr5的生物学特性奠定物质基础。【方法】以稳定表达人Lgr5的基因转染细胞株CHO/Lgr5为免疫原，常规免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经HAT选择培养，以CHO/Lgr5细胞株作为阳性筛选细胞株，以转染pIRES2-EGFP空

7、载体的CHO/Mock细胞作为阴性对照细胞株，经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养，获得1株持续、稳定分泌鼠抗人Lgr5单克隆抗体的杂交瘤细胞株；利用细胞核染色体计数、Ig亚型快速定性试纸法、Western-blot、免疫细胞化学法等试验，对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行生物学特性的鉴定；利用单克隆抗体9B3检测Lgr5在结直肠癌组织、癌旁组织及远端正常组织的表达差异。【结果】（1）成功获得一株稳定特异性分泌鼠抗人Lgr5单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为9B3。经体外连续培养半年以上，液氮冻存后复苏